樊淑華，王永立

（周口師范學院生命科學與農學學院，河南周口466001）

膠體金免疫層析技術（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是以膠體金做為示蹤物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。自1971年Faulk W P和Taylor G M［1］首次創(chuàng)立膠體金免疫層析技術在大腸埃希菌應用以來，該技術已成為繼熒光標記、酶標記和放射性免疫標記之后的又一種新型的免疫標記技術。本文綜述了近4年來膠體金免疫層析技術在動物疾病檢測、毒物及藥物殘留、重金屬離子監(jiān)測等方面的最新研究進展。

1 膠體金免疫層析技術在疾病監(jiān)測中的應用

在應用膠體金免疫層析技術檢測動物病毒中基本都采用雙抗體夾心法。該方法多用膠體金標記單克隆抗體作為捕捉抗體（capture antibody，cAb），可與樣品中的抗原特異性結合；將另一株單克隆抗體（或多抗）包被檢測線作為檢測抗體（detection antibody，dAb），用抗標記單克隆抗體的多抗包被質控線作為質控抗體（control antibody）以檢測試紙條的有效性。當待檢樣本中含有檢測抗原時，在檢測區(qū)和質控區(qū)出現(xiàn)兩條肉眼可見的紅色條帶，反之則僅在質控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶。該技術廣泛應用于動物病毒性疫病、動物細菌性疾病及人畜共患病的監(jiān)測中。

1.1 膠體金免疫層析技術在病毒性疾病監(jiān)測中的應用

膠體金免疫層析技術在動物病毒性疾病，特別是在豬圓環(huán)病毒、口蹄疫病毒及豬瘟病毒等病毒的檢測中應用廣泛。如Jin Q 等［2］采用重組核衣殼蛋白作為檢測抗原建立了檢測豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）的膠體金免疫層析方法，并采用該方法和商品化ELISA 試劑盒分別對500 份臨床血清樣品進行檢測，其符合率為94%。表明該方法具有良好的特異性和敏感性。Jiang T 等［3］以豚鼠抗口蹄疫病毒（FMDV）的多抗作為捕捉抗體，以兔抗FMDV 的多抗為檢測抗體，羊抗豚鼠的二抗作為質控抗體建立了檢測FMDV A 亞型的雙抗體夾心免疫層析方法，該方法與其他亞型FMDV、豬水皰病病毒、豬水皰性口炎病毒之間均無交叉反應，其檢測極限為11.7ng／mL。臨床檢測結果表明，該方法與雙抗體夾心ELISA 方法具有一致的敏感性和特異性，且操作簡單快速，15min內能夠得出檢測結果，是一種適合于臨床檢查的快速診斷方法。Li X 等［4］在大腸埃希菌BL21中表達豬瘟病毒（CSFV）E0 和E2 蛋白主要抗原域，以純化的嵌合蛋白（CnC2）為抗原建立了快速檢測豬瘟血清中CSFV 疫苗抗體滴度的免疫膠體金試紙條。該研究以嵌合蛋白作為捕捉抗原，以SPA 和抗CnC2 的單克隆抗體分別包被檢測線和質控線，研制的試紙條與商業(yè)化的ELISA 試劑盒的檢測符合率為93.5%，敏感性和特異性分別為97.0% （65／67）、100% （98／98），特別適合于豬瘟抗體滴度的大范圍臨床監(jiān)測。除采用病毒蛋白作為檢測抗原外，Yang S等［5］還發(fā)明了一種基于合成肽技術的免疫膠體金試紙條，該研究從FMDV 非結構蛋白中篩選了一條能夠與FMDV 感染豬血清發(fā)生陽性反應，而不能與疫苗接種豬血清發(fā)生反應的多肽，并以該多肽作為檢測抗原，研制出能夠區(qū)別O型口蹄疫病毒感染豬與疫苗免疫豬的膠體金試紙條，該試紙條與商業(yè)化Ceditest（R）ELISA 和UBI（R）ELISA 試劑盒的符合率分別為98.59% 、96.63%，并具有良好的特異性和敏感性。另外，膠體金免疫層析技術在其他動物病毒性疾病如魚類疾病的檢測中也應用廣泛，如Sheng X Z 等［6］研制了檢測魚淋巴囊腫病毒（Lymphocystis disease virus，LCDV）快速檢測試紙條，該研究采用抗LCDV 的兩種單克隆抗體2D11和1A8分別作為捕捉抗體和檢測抗體，以羊抗鼠的二抗為質控抗體組裝試紙條，與商業(yè)化試紙條和點印跡法的平行檢測證明該方法具有很高的特異性和敏感性，極限檢測值為1 μg／mL，室溫下可保存6個月，4 ℃能保存12個月，具有較高的穩(wěn)定性。

近年來，人畜共患病頻發(fā)，危害日趨嚴重，如不同亞型的禽流感病毒引發(fā)的高死亡率及存在人與人之間傳染的潛在可能性，使這些病原的快速、特異的檢測方法的建立成為迫切需要。而膠體金免疫層析技術不僅具有較強的特異性，而且檢測迅速，不需要特殊的儀器設備，特別適用于疾病現(xiàn)場的大規(guī)模檢測。如Miyoshi Akiyama T 等［7］以抗H1N1亞型流感病毒NP蛋白的單克隆抗體為捕捉抗體，建立了特異性檢測2009年H1N1亞型大流感（AH1pdm）的膠體金試紙條。試驗表明，該試紙條能夠特異性檢測AH1pdm，且不與季節(jié)性H1N1、H3N2 亞型和B型流感病毒發(fā)生交叉反應，具有較強的特異性；采用該方法和PCR 方法平行對臨床分離的5份人AH1pdm 樣品進行檢測，兩種方法檢測結果一致且都為陽性，說明該試紙條具有較強的敏感性。Kang K等［8］采用抗血凝素（HA）的特異單克隆抗體建立了檢測2013年H7N9亞型禽流感的免疫層析方法。該方法檢測 H7N9 流感病毒的最低檢測極限為103TCID50，能夠從重組HA 抗原中特異檢測H7亞型，包括H7N9和H7N7亞型病毒，不會與其他亞型如H1N1、H3N2、H5N1、H5N9和H9N1亞型發(fā)生交叉反應。對病人（RT-PCR 方法確診）的檢測敏感性為59.4%（19／32），對陽性唾液樣品的檢測敏感性為61.5%（16／26），對180份陰性樣品的檢測中未出現(xiàn)假陽性，說明該方法具有較好的特異性。這些免疫層析方法的建立對于流感的防控起到了積極的預防作用。

1.2 膠體金免疫層析技術在細菌性疾病監(jiān)測中的應用

膠體金免疫層析技術也廣泛應用于動物細菌性疾病的檢測中，如用于豬鏈球菌、兔土拉桿菌等病原的檢測。Ju Y 等［9］研制了出檢測豬2 型鏈球菌的膠體金試紙條，該方法的檢測敏感度高達106CFU／mL，與其他血清型的鏈球菌（除SS1／2型以外，因SS1／2與2型鏈球菌具有相同的抗原決定簇）無交叉反應。Kilic S等［10］研制出檢測野兔熱土拉桿菌的膠體金試紙條，與微量凝集試驗結果相比，該方法的敏感性和特異性分別為99.3% 和94.6%。該方法在檢測正常血清樣品，自身免疫性疾病及細菌、病毒和寄生蟲感染的血清學樣品時均無交叉反應。Moongkarndi P等［11］建立了快速檢測鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的的膠體金方法，該研究分別使用了抗鼠傷寒和抗腸炎沙門菌兩種單克隆抗體，與特異性識別鼠傷寒的單克隆抗體組裝成了雙夾心的試紙條。該試紙條能夠快速檢測培養(yǎng)基中的鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，檢測極限分別為104和106CFU／mL。臨床檢測結果表明，該方法檢測鼠傷寒和腸炎沙門菌的敏感性分別為98.89% （89／90）和87.50% （70／80）。與商業(yè)化的檢測方法相比，該試紙條的特異性為100%，且該試紙條是首個同時檢測兩種不同的沙門菌的膠體金方法，為養(yǎng)雞場和其他肉制品的大批量檢測提供了一種簡單、快速的檢測手段。Shukla S 等［12］建立了一種基于脂質體的免疫膠體金方法，該方法使用熒光染料磺酰羅丹明B標記免疫脂質體（脂質體與親和純化的羊抗沙門菌IgG 的多克隆抗體），分別將羊抗沙門菌IgG 的多克隆抗體和兔抗羊的IgG 作為檢測抗體和質控抗體，結果表明，該方法的檢測極限為102CFU／mL，遠遠高于商業(yè)化試紙條的檢測極限（107CFU／mL）。另外，膠體金免疫層析技術在細菌性人畜共患病的檢測中也得到了進一步應用，如在霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌及結核分支桿菌的檢測中，霍亂弧菌是引起霍亂的一種食源性致病菌，人類常因誤食海鮮制品而患病。Pengsuk C等［13］建立并評估了檢測海鮮制品中霍亂弧菌O139 的免疫試紙條，該試紙條使用了抗霍亂弧菌脂多糖和莢膜多糖的兩種單克隆抗體，即VC-273 和VC-812；其中VC-273作為捕捉抗體噴涂在玻璃纖維上與樣品墊相連，VC-812和羊抗鼠的IgG 分別作為檢測抗體和質控抗體噴涂于硝酸纖維素膜上。評估試驗表明，該試紙條的檢測敏感性為104CFU／mL，且將檢測樣品在堿性蛋白胨水中孵育12h后其檢測極限可達到1 CFU／mL。金黃色葡萄球菌也是一種重要的人畜共患致病菌，同時也是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，人類常由于誤食污染的牛乳而導致食物中毒。布日額等［14］研制了檢測牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金試紙條，檢測結果表明該試紙條具有較好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。Wassie L 等［15］研制了一種快速診斷臨床肺結核桿菌的免疫層析試紙條，該研究首先通過ELISA 方法篩選到一組能夠被肺結核病人血清識別但不與對照組血清反應的抗原，再將這些抗原按照免疫層析方法進行組裝，并用組裝的試紙條對來自埃塞俄比亞（肺結核高發(fā)國家）和土耳其（地方流行區(qū)）臨床上不同健康狀況（包括肺結核感染病人、密切接觸病人及健康對照組）人群的血清樣品進行檢測。結果表明，該方法特異性高達97%以上，但對肺結核的敏感性僅為46%～54%。雖然該方法在臨床診斷中敏感性不高，但具有較高的特異性，可為臨床檢測提供參考。Mdluli P 等［16］利用改進的雙通道膠體金免疫層析技術建立了檢測肺結核抗體的膠體金試紙條。該試紙條能夠更有效的檢測全血和血清樣品中的結核分支桿菌抗體，且該試驗中采用ESE 讀數(shù)儀對檢測線抗體的濃度進行了半定量化，使檢測結果更加準確可信。

2 膠體金免疫層析技術在食品藥物殘留檢測中的應用

膠體金免疫層析技術在食品藥物殘留中的檢測不僅包括對抗生素殘留、磺胺類藥物殘留等方面［17］的檢測，還包括對三聚氰胺、黃曲霉毒素及地高辛等治療藥物殘留的檢測。Byzova N A 等［18-19］建立了檢測牛奶中氯霉素和鏈霉素的免疫層析試紙條，并對其敏感性和穩(wěn)定性進行了優(yōu)化，氯霉素的檢測極限值為10ng／mL。鏈霉素的檢測與傳統(tǒng)ELISA 方法符合率在93%以上。另外，Byzova N A 等［20］還建立了檢測動物源性食品中氧氟沙星的免疫層析方法。氧氟沙星的檢測極限值為30ng／mL，符合食品安全評估的需要，臨床檢測結果表明該方法不僅能夠檢測牛奶中的氧氟沙星，而且能夠檢測雞肉和豬肉樣品中殘留的氧氟沙星。Gong Y 等［21］建立了快速檢測三聚氰胺的膠體金方法，該研究采用抗三聚氰胺的單克隆抗體為檢測抗體，檢測極限值為50 mg／L。該方法可用于牛奶、奶粉、肉制品中三聚氰胺的檢測，其中牛奶的檢測極限值為100 mg／L，奶粉為100ng／g，其他食品為200ng／g。與質譜方法相比，免疫層析法更適用于大量奶制品中三聚氰胺的檢測。Gao S等［22］建立了快速檢測食品中相思豆毒素的免疫層析方法，該試紙條由鼠抗相思豆毒素A 鏈的單克隆抗體和兔抗相思豆毒素的多克隆抗體組裝而成，該方法可在10 min內得出檢測結果，最低檢測極限為3ng／mL，且與其他相關的毒素無交叉反應。

為解決目前免疫層析方法檢測黃曲霉毒素B1（AFB1）選擇性較差的問題，Zhang D 等［23］建立了一種新的檢測黃曲霉毒素的免疫層析法，該研究采用了兩種特異性更強的單克隆抗體，其中抗黃曲霉毒素B的單克隆抗體AFB（2a）-BSA 和其他文獻報道中采用的AFB（1）-BSA 抗體相比，具有更高的特異性，很好的避免了樣品檢測過程中假陽性的出現(xiàn)；對天然污染的樣品如花生、普洱茶、植物油、飼料等農產品的檢測結果表明，該方法與高效液相色譜法結果一致，可作為農產品中黃曲霉毒素檢測的常用方法。

Omidfar K 等［24］建立了監(jiān)測病人血液中地高辛的納米膠體金檢測方法，該技術可在5min內完成對地高辛的定量檢測，檢測時間比放射免疫檢測縮短了近20 倍～30 倍，肉眼觀察檢測敏感度為2ng／mL，該濃度在治療過程中地高辛有毒濃度以內，血清樣品檢測的敏感度和精確度與放射免疫測定法結果一致。因此，該方法可作為快速檢測血液樣品中地高辛的一種新手段。

3 膠體金免疫層析技術在重金屬離子檢測中的應用

隨著工業(yè)化程度的不斷發(fā)展，許多重金屬離子持續(xù)污染水資源，對環(huán)境和人類健康造成了嚴重的危害。雖然有些重金屬離子如銅、鋅、鉻、錳等為人類必需的微量元素，但過量攝取也會導致機體中毒。目前重金屬離子的檢測方法有火焰原子吸收光譜、液液萃取、分光光度法、化學發(fā)光法等，但這些方法不僅需要昂貴的設備，而且費時費力。免疫層析法不僅具有較強的敏感性和特異性，而且便于操作，因此也廣泛用于重金屬離子的檢測。Liu X［25］建立了檢測水和血清樣品中Cr3＋和Cr6＋的納米金層析方法，該方法以親和純化的抗螯合劑isothiocyanobenzyl-EDTA（iEDTA）單克隆抗體作為檢測抗體，使用0～80ng／mL的鉻離子標準品進行檢測，結果表明該方法的最低檢測限為50.0ng／mL，且能夠對血清樣品中的鉻離子進行檢測。該試紙條37 ℃條件下存放12周后，不影響其生物學活性，與其他重金屬離子無交叉反應。說明該試紙條具有一定的穩(wěn)定性和較強的特異性。免疫層析試紙條攜帶方便、檢測迅速，特別適用于鉻離子污染水的大量檢測及鉻離子的生物監(jiān)測等領域。牡蠣是一種鉻含量較高的食物，Nishi K 等［26］建立了檢測牡蠣中鉻離子的膠體金方法。該研究首先使用0.1mol／L HCl從牡蠣中提取鉻離子，采用陰離子交換法去除其他離子。隨后采用電感耦合等離子分析技術檢測5種金屬離子Mn、Fe、Cu、Zn和Cd的含量。檢測結果表明，使用HCl能夠提取牡蠣中大多數(shù)的鉻離子，且采用陰離子交換法去除其他離子的過程中不會造成鉻離子的損失。該方法檢測結果與電感耦合等離子質譜法的一致率為97%。表明該技術是一種可靠的檢測牡蠣中鉻離子的實用方法。Tang Y 等［27］建立了快速檢測水中鉛離子的免疫膠體金方法，該方法的最低檢測限為50ng／mL。與電感耦合等離子質譜檢測平行檢測結果表明，該方法具有較強的特異性和敏感性，是一種能夠應用于水中鉛離子場地快速檢測的實用方法。水銀是水中最危險的一種污染品，低濃度即能對環(huán)境和人類健康造成嚴重危害。Zhou Y 等［28］建立了檢測水中汞離子的競爭免疫層析方法，該方法可在15min內快速檢測水中的Hg2＋，且不需對樣品進行復雜的樣品前處理，不需要精密的儀器和設備。

4 展望

膠體金免疫層析技術是一種新型檢測方法，具有簡單快速、結果清晰，無需復雜的操作技巧和特殊設備及攜帶方面等優(yōu)點。已成為臨床快速診斷領域發(fā)展的一個新方向。但由于只能用于定性或半定量的檢測，難以滿足臨床檢測指標定量化的要求，且靠肉眼判斷檢測結果，存在靈敏度較低等問題，需要進一步完善。新型膠體金免疫層析技術在以上問題上進行了改進，克服了上述不足。Zhou G 等［29］將棉線等材料引入免疫層析技術中，用棉線和尼龍纖維束代替樣品墊和硝酸纖維素膜。并且將棉線和尼龍纖維束進行打結形成框架結構，從而實現(xiàn)了多個樣品的高通量檢測。不僅如此，該方法還采用平板掃描儀對試驗結果進行定量分析，克服了免疫層析法無法定量的缺點。而最新發(fā)展的免疫層析技術以特有的光電磁信號放大系統(tǒng)、親和素-生物素放大技術提高檢測靈敏度，減少樣品的本底干擾。如熒光乳膠層析技術，在原有免疫層析基礎上，在纖維膜上預包被彩色熒光乳膠標記的抗原或抗體，可應用于免疫分析儀檢測熒光信號，擁有傳統(tǒng)標記物所無法比擬的優(yōu)勢?？傊庖邔游龇治黾夹g在滿足檢測快速而簡便的前體下，若能夠進一步提高檢測的特異度和靈敏度，減少假陰性和假陽性，實現(xiàn)定量檢測，必能夠在基層臨床檢測中發(fā)揮更大的作用。

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