李曉彤，江　凌,2，胡　燚，朱麗英，徐　嫻

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇 南京 210009；3.南京工業(yè)大學理學院，江蘇 南京 210009)

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)即三酰基甘油?；饷福且环N特殊的酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化油脂的水解反應，生成脂肪酸和甘油、甘油單酯或二酯[1-2]。脂肪酶通常被用于在非水相體系中催化油脂及其它一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化以及酯類逆向合成等反應[3-5]，由于其高效專一、反應條件溫和等特點，已被應用于化工、食品、制藥等領域[6]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)脂肪酶A(LipA)是最小的脂肪酶之一，屬于α/β-折疊水解酶。2001年，Pouderoyen等[7]報道了LipA的晶體結構特征，這是第1個獲得解析的芽孢桿菌脂肪酶晶體結構。晶體結構分析發(fā)現(xiàn)，LipA缺乏多數(shù)脂肪酶都具有的α-螺旋形成的“蓋子結構”，因此，在油水界面和有機溶劑中都有催化活性，沒有其它脂肪酶具有的“界面激活”效應[8]。并且，與其它脂肪酶的保守的五肽序列Gly-X-Ser-X-Gly不同，LipA的保守序列為Ala-X-Ser-X-Gly(Ser參與組成活性中心催化三聯(lián)體)，這一結構特征與真菌(Candidaantarctica)脂肪酶 B(CALB)很相似[9]，這表明LipA更接近于真菌脂肪酶而不是細菌脂肪酶。正是由于LipA獨特的分子結構，使其在手性藥物中間體拆分領域具有巨大潛力，已引起廣泛關注[10]。然而，LipA是一個常溫酶，最適溫度僅為25 ℃，野生型的LipA在50 ℃下的酶活力僅為最適溫度下的一半[11]。較差的熱穩(wěn)定性限制了它在工業(yè)生產(chǎn)中的進一步應用，但是也為其穩(wěn)定性改造提供了進化空間，也使得LipA成為了一個理想的改造對象。

研究表明，通過單一氨基酸殘基的置換來降低蛋白質去折疊時的骨架熵可以使蛋白質的熱穩(wěn)定性得到一定的提高，而脯氨酸(Pro)在這一理論中起關鍵作用[12]。Pro的N-Cα旋轉受到其吡咯烷環(huán)的束縛，從而具有更小的構象自由度，同時限定其前面氨基酸只有有限的構象空間，這種結構使得它比其它氨基酸更能增加蛋白質的剛性。相對地，甘氨酸(Gly)由于沒有側鏈，具有靈活的構象，則可增加蛋白質的柔性[12-14]。對此，Suzuki等[15]、Watanabe等[16]提出了“脯氨酸理論”，認為只要主鏈構象不發(fā)生驟變，在適當?shù)摩?轉角或無規(guī)卷曲位置引入Pro，就可以通過降低蛋白質去折疊時的骨架熵提高蛋白質的熱穩(wěn)定性。這一理論已應用于多種酶的熱穩(wěn)定性改造實驗并得到了證實[14,17-18]。

結合“脯氨酸理論”，作者采用分子動力學模擬的方法，通過分析LipA的Rmsf圖及其分子結構模型，確定位于柔性較高Loop區(qū)域的Gly52和Gly158作為突變位點，將Gly突變?yōu)镻ro,并通過分子生物學實驗驗證預測結果，分別考察了野生型LipA和突變株LipAG52P、LipAG158P的比活力、耐溫性等相關酶學性質。

1　實驗

1.1　菌株及載體質粒

Bacillussubtilis168，自行保藏。

EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21 (DE3)、pET-22b質粒，Novagen公司。

1.2　培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，用蒸餾水配制，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌 20 min。

LB 固體培養(yǎng)基：在 LB 液體培養(yǎng)基的基礎上再加 1.5%～2.0%的瓊脂。

1.3　重組質粒的構建

1.3.1LipA基因的獲取及PCR擴增

提取Bacillussubtilis168基因組(采用Takara公司的提取基因組試劑盒)，根據(jù)Genbank中枯草芽孢桿菌基因組的序列(登錄號為AL009126.3)，設計合成一對PCR引物進行目的基因擴增并回收PCR產(chǎn)物：

上游引物：5′-CCGCATATGGCTGAACACAA-TC-3′；

下游引物：5′-CCCAAGCTTATTCGTATTCTGGC-3′。

上下游引物的5′-端分別設計了NdeⅠ和HindⅢ酶切位點用于連接到表達載體pET-22b，以Bacillussubtilis168菌株DNA為模板進行PCR擴增，PCR條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.3.2LipA基因與質粒的酶切

在含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴增含有質粒的菌株，提取質粒(采用Takara公司的提取質粒試劑盒)。

選擇NdeⅠ和HindⅢ為酶切位點，對Bacillussubtilis168基因組和pET-22b質粒進行雙酶切操作，質粒雙酶切產(chǎn)物去磷酸化后與LipA基因連接，核酸電泳驗證。

1.3.3重組質粒的轉化

采用氯化鈣轉化法，將重組質粒轉入E.coliDH5α中構建DH5α-pET22b-LipA，涂布含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)并保存。

1.4　LipA基因的定點突變和蛋白表達

1.4.1全質粒PCR擴增

采用全質粒PCR擴增的方法進行定點突變，設計含有Gly52Pro和Gly158Pro的全質粒PCR引物，序列如下：

引物1：

S鏈：5′-CGCCATTTATAACAATCCACCGGT-3′；

A鏈：5′-ACCGGTGGATTGTTATAACTTGG-G-3′；

引物2：

S鏈：5′-CGCCATGTTGGACACATCCCCCT-3′；

A鏈：5′-GCTGTACAGAAGGGGGATGTCTTGGG-3′。

用PrimSTAR對全質粒進行擴增，PCR反應液：5×Prime STAR Buffer (Mg+plus) 10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 4 μL，Prime2 (10 μmol·L-1) 1 μL，模板DNA<200 ng，PrimeSTAR HS、DNA Polymerase (2.5 U ·μL-1)各0.5 μL，滅菌蒸餾水補充至50 μL，PCR擴增產(chǎn)物約為629 bp。

1.4.2全質粒擴增的產(chǎn)物轉化

從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細胞E.coliDH5α，立即放入冰中融化。加入10 μL連接產(chǎn)物在冰上冷卻30 min，將混合物在42 ℃熱休克90 s(勿搖晃)，立即放到冰浴中冷卻2 min，再加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下振蕩培養(yǎng)30 min，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，轉接LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，構建LipA突變株。酶切鑒定篩選重組表達質粒，并對其測序以確定突變克隆。

1.4.3LipA的誘導表達

提取DH5α-pET22b-LipA和突變株質粒，分別轉化至表達載體E.coliBL21 (DE3)中，構建LipA 工程菌BL21-pET22b-LipA，涂布含有氨芐青霉素的LB平板過夜培養(yǎng)。挑取轉化子于含50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)約2 h，當OD600達到0.6～0.8時，加入IPTG使其終濃度達到0.5 mmol·L-1，置于30 ℃搖床上繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h進行誘導表達。

1.5　LipA的分離和純化

將發(fā)酵液離心，收集菌體，用與發(fā)酵液同等體積的Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.4)重懸菌體，超聲破碎細胞，至菌液澄清后于12 000 r·min-1離心15 min,收集上清液，即為LipA的粗酶液。采用Ni柱親和層析的方法對粗酶液進行純化后,置于4 ℃環(huán)境下保存。SDS-PAGE電泳驗證純化效果。

1.6　酶學性質的研究

1.6.1酶活力測定

采用p-NPP法測脂肪酶活力，并繪制p-NP濃度標準曲線。96孔板中分別加入240 μL底物溶液與10 μL酶液(空白對照加入10 μL蒸餾水)，40 ℃下反應10 min，于405 nm處測定吸光度。依據(jù)標準曲線計算酶活力。

酶活力單位定義：每分鐘催化p-NPP水解生成1 μmol的p-NP所需的脂肪酶量為1 U。

1.6.2蛋白濃度測定

采用Bradford法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白繪制濃度標準曲線，分別測定原始菌與突變菌發(fā)酵液中蛋白濃度。

1.6.3熱穩(wěn)定性測定

將野生型LipA和LipAG52P、LipAG158P分別于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃下保溫30 min，測定殘余酶活力。以未經(jīng)溫浴條件下所測得的酶活力為100%，將經(jīng)過不同溫度熱處理后所測得的酶活力折合為相對剩余酶活力，對溫度作圖。相對剩余酶活力為50%所對應的溫度為酶的Tm值。

1.6.4動力學參數(shù)測定

使用SpectraMax M3多功能酶標儀(Molecular Devices公司)測定LipA和LipAG52P、LipAG158P動力學參數(shù)，每30 s測定405 nm波長處吸光度，對時間作圖。根據(jù)米氏方程力計算Km、kCat等相關參數(shù)。

1.7　分子動力學模擬

采用GROMACS4.5.4軟件進行分子動力學模擬，體系在中性條件下，溶劑模型SPC，力場為GROMOS9653a6，溫度為300 K。體系首先采用最速下降法能量最小化(steepest descent)進行優(yōu)化；然后固定蛋白，采用壓力(parrinello-rahman)與溫度(V-rescale)進行500 ps約束優(yōu)化；最后進行分子動力學模擬，放松蛋白，時間步長為2 fs，模擬時間為10 ns。體系每隔1 ps收集一次數(shù)據(jù)，得出分析均方根偏差RMSD(root mean square deviation)值與均方根漲落Rmsf(root mean square fluctuation)曲線。

2　結果與討論

2.1　突變位點的確定

圖1　LipA三維結構模型

采用分子動力學模擬的方法，得到野生型LipA的Rmsf值(圖2)。Rmsf值越高則分子柔性越大、穩(wěn)定性越低，從而確定野生型LipA柔性較高的區(qū)域(第151～156位、第109～124位、第130～138位、第38～48位)。結合上述LipA晶體結構，選取位于柔性較高Loop區(qū)域附近的Gly殘基作為突變位點突變?yōu)镻ro，分別確定為Gly153、Gly155、Gly158、Gly111、Gly116、Gly46、Gly52。

圖2　野生型LipA在300 K平衡時間段的Rmsf值

2.2　分子動力學模擬預測突變體的熱穩(wěn)定性

實驗采用GROMACS4.5.4軟件進行分子動力學模擬，通過聯(lián)合分析均方根漲落Rmsf值(圖2)與均方根偏差RMSD值(圖3)，分析引入的Pro突變位點對LipA熱穩(wěn)定性的貢獻。

圖3　野生型和突變株LipA的RMSD值隨時間變化的演示圖

由圖3可知，6 000 ps后蛋白的構象趨于穩(wěn)定，最終2 ns時野生型LipA的平均RMSD值為(0.59±0.01) nm，突變株LipAG52P和LipAG158P的平均RMSD值分別為(0.43±0.02) nm和(0.44±0.02) nm，低于野生型LipA；而其它5種突變株LipAG153P、LipAG155P、LipAG111P、LipAG116P、LipAG46P的平均RMSD值均高于野生型LipA。RMSD值越低則分子構象越穩(wěn)定，因此得到提高LipA熱穩(wěn)定性的重要氨基酸位點是Gly52和Gly158(圖4)。

圖4　突變位點3D結構模型

2.3　突變體的獲得

經(jīng)NdeⅠ和HindⅢ酶切鑒定和DNA測序結果表明：突變表達質粒pET22b-LipAG52P、pET22b-LipAG158P構建成功，其電泳圖譜如圖5所示。

2.4　酶學性質及動力學特性的測定

粗酶液經(jīng)Ni柱純化后，采用SDS-PAGE電泳驗證純化過程中各收集液的蛋白條帶，如圖6所示。

由圖6可知，酶液最終僅為一條大小為20.1 kDa的單一條帶，達到了理想的純化效果。

測得野生型LipA和LipAG52P、LipAG158P的酶活力、Km值等相關參數(shù)如表1所示。

由表1可知，LipAG52P、LipAG158P的比活力分別是野生型LipA的5.6倍和2.7倍，LipA的催化效率(kCat/Km)為5.21×10-2L·mmol-1·min-1，LipAG52P和LipAG158P的催化效率分別較LipA提高了85%(9.65×10-2L·mmol-1·min-1)和22%(6.35×10-2L·mmol-1·min-1)。

1，3：LipAG52P、LipAG158P質?！?，4：Nde Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切處理后LipAG52P、LipAG158P質粒片段　M：DNA Marker

M.DNA Marker　1～5.純化過程中各個階段收集的流出液

表1　野生型LipA和LipAG52P、LipAG158P相關酶學性質

由圖7可知，各溫度下處理30 min后突變株的殘余酶活力均比野生型LipA高。在40 ℃處理30 min后，野生型LipA的殘余酶活僅為32.14%，而突變株LipAG52P和LipAG158P的殘余酶活分別為78.35%和63.51%。在50 ℃處理30 min后，野生型LipA喪失

2.5　熱穩(wěn)定性分析(圖7)

圖7　野生型LipA、LipAG52P和LipAG158P的熱穩(wěn)定性

了90%的酶活，LipAG158P喪失了近80%的酶活，而LipAG52P仍保留了60%的殘余酶活。此外，野生型LipA的Tm值為38 ℃，LipAG52P和LipAG158P的Tm值則分別提高了15 ℃和7 ℃。這說明LipAG52P、LipAG158P的熱穩(wěn)定性較野生型LipA有明顯的提高。

2.6　討論

趙博等[20]采用定向進化的方法經(jīng)過兩輪易錯 PCR以及高通量篩選，最終獲得了比活力為野生出發(fā)酶4.5倍的突變體。Le等[21]通過A162C和K308C雙突變使CALB的Tm值提高了8.5 ℃。蔡少麗等[22]利用重疊延伸PCR方法對擴展青霉脂肪酶基因進行體外定點突變，得到的雙突變體脂肪酶PEL-ep8-K115R-GS的Tm值比野生型脂肪酶PEL-GS提高3.5 ℃?？梢姡鞍踪|分子設計與改造能改善酶的熱穩(wěn)定性。

本研究以LipA(PDB：1I6W)為研究對象，在計算機輔助設計的基礎上將“脯氨酸理論”應用于LipA的熱穩(wěn)定性改造上，通過分子動力學模擬分析其三維結構找出相關的脯氨酸位點，并預測定點突變LipA后對其熱穩(wěn)定性的影響。既避免了現(xiàn)有技術中非理性設計方法需要面臨的篩選容量大、過程復雜等難題，同時簡化了理性設計方法，使得蛋白質的定點突變更具有針對性，并最終成功實現(xiàn)了LipA的熱穩(wěn)定性的顯著提高，通過本實驗得到的突變株LipAG52P、LipAG158P不僅比活力和熱穩(wěn)定性均強于野生型LipA，而且催化效率也得到了一定的提高。

3　結論

以LipA為研究對象，根據(jù)從RCSB數(shù)據(jù)庫中獲取的晶體結構，采用分子動力學模擬和分子生物學實驗相結合的方法進行脂肪酶熱穩(wěn)定性位點突變的理性設計。首先，利用分子動力學模擬獲得晶體結構中柔性較高的Loop區(qū)域；進而，結合“脯氨酸理論”，將位于該區(qū)域附近的Gly殘基突變?yōu)镻ro，分析引入Pro突變對LipA熱穩(wěn)定性的影響，篩選得到Gly52和Gly158兩個突變位點；最后，通過定點突變操作對突變株LipAG52P和LipAG158P進行熱穩(wěn)定性實驗驗證。結果顯示，突變株LipAG52P、LipAG158P的比活力分別是野生型LipA的5.6倍和2.7倍，Tm值分別提高了15 ℃和7 ℃，并且催化效率分別提高了85%和22%。

參考文獻：

[1]MA J H,ZHANG Z M,WANG B J,et al.Overexpression and characterization of a lipase fromBacillussubtilis[J].Protein Expression and Purification,2006,45(1):22-29.

[2]JOSEPH B,RAMTEKE P W,THOMAS G.Cold active microbial lipases:Some hot issues and recent developments[J].Biotechnology Advances,2008,26(5):457-470.

[3]REJASSE B,MAUGARD T,LEGOY M D.Enzymatic procedures for the synthesis of water-soluble retinol derivatives in organic media[J].Enzyme and Microbial Technology,2003,32(2):312-320.

[4]RUFINO A R,BIAGGIO F C,SANTOS J C,et al.Screening of lipases for the synthesis of xylitol monoesters by chemoenzymatic esterification and the potential of microwave and ultrasound irradiations to enhance the reaction rate[J].International Journal of Biological Macromolecules,2010,47(1):5-9.

[5]YANG K S,SOHN J H,KIM H K.Catalytic properties of a lipase fromPhotobacteriumlipolyticumfor biodiesel production containing a high methanol concentration[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2009,107(6):599-604.

[6]JAEGER K E,EGGERT T.Lipases for biotechnology[J].Current Opinion in Biotechnology,2002,13(4):390-397.

[7]POUDEROYEN G,von EGGERT T,JAEGER K E,et al.The crystal structure ofBacillussubtilislipase:A minimalα/βhydrolase fold enzyme[J].Journal of Molecular Biology,2001,309(1):215-226.

[8]ACHARYA P,RAJAKUMARA E,SANKARANARAYANAN R.Structural basis of selection and thermostability of laboratory evolvedBacillussubtilislipase[J].Journal of Molecular Biology,2004,341(5):1271-1281.

[9] 趙博,高仁鈞,廉虹,等.枯草桿菌脂肪水解酶 LipA 和LipB[J].中國生物化學與分子生物學,2008,24(5):419-425.

[10]DETRY J,ROSENBAUM T,LüTZ S,et al.Biocatalytic production of enantiopure cyclohexane-trans-1,2-diol using extracellular lipases fromBacillussubtilis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,72(6):1107-1116.

[11]REETZ M T,CARBALLEIRA J D,VOGEL A.Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability[J].Angewandte Chemie,2006,45(46):7745-7751.

[12]MATTHEWS B W,NIHOLSON H,BECKTEL W J.Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1987,84(19):6663-6667.

[13]ZHOU C,XUE Y F,MA Y H.Enhancing the thermostability ofα-glucosidase from thermo anaerobactertengcongensis MB4 by single proline substitution[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,110(1):12-17.

[14]GOIHBERG E,DYM O,TEL-OR S.A single proline substitution is critical for the thermostabilization ofClostridiumbeijerinckiialcohol dehydrogenase[J].Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,2007,66(1):196-204.

[15]SUZUKI Y,OISHI K,NAKANO H.A strong correlation between the increase in number of proline residues and the rise in thermostability of fiveBacillusoligo-1,6-glucosdiases[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1987,26:546-551.

[16]WATANABE K,CHISHIRO K,KITAMURA K,et al.Proline residues responsible for thermostability occur with high frequency in the loop regions of an extremely thermostable oligo-1,6-glucosidase fromBacillusthermoglucosidasiusKP1006[J].Journal of Biological Chemistry,1991,266:24287-24294.

[17]SCHULTZ D A,FRIEDMAN A M,WHITE M A,et al.The crystal structure of thecis-proline to glycine variant (P114G) of ribonuclease A[J].Protein Science,2005,14(11):2862-2870.

[18]TIAN J,WANG P,GAO S.Enhanced thermostability of methyl parathion hydrolase fromOchrobactrumsp.M231 by rational engineering of a glycine to proline mutation[J].FEBS Journal,2010,277(23):4901-4908.

[19]NTHANGENI M B,PATTERTION H,van Tonder A,et al.Over-expression and properties of a purified recombinantBacilluslicheniformislipase:A comparative report onBacilluslipases[J].Enzyme and Microbial Technology,2001,28(7-8):705-712.

[20]趙博,陶進,馬吉勝,等.定向進化提高枯草芽孢桿菌脂肪酶的活力[J].催化學報，2009,30(4):291-296.

[21]LE Q A T,JOO J C,YOO Y J,et al.Development of thermostableCandidaantarcticalipase B through novel in silico design of disulfidebridge[J].Biotechnology and Bioengineering,2012,109(4):867-876.

[22]蔡少麗,鄒有土,黃建忠,等.定點突變對擴展青霉脂肪酶熱穩(wěn)定性的改善[J].應用與環(huán)境生物學報,2013,19(1):43-47.