余　梅，阮小文，譚麗泉，盧玉娟

(1.廣東石油化工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院,廣東 茂名 525000；2.茂名市環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 茂名 525000)

白腐真菌(white rot fungi)是一種能夠引起木材白色腐朽病的擔(dān)子菌,它可以在木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi)產(chǎn)生胞外氧化酶,該酶具有很強(qiáng)的降解木質(zhì)素大分子的能力,其降解過程包括木質(zhì)素碳水化合物結(jié)合體的分解、苯基丙烷的分解、側(cè)鏈分解以及芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的開裂[1]。白腐真菌主要通過分泌非專一性的降解酶系以單電子氧化、共代謝及脂肪過氧化等途徑進(jìn)行降解活動(dòng)。白腐真菌的降解酶系統(tǒng)主要包括3種酶：木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(manganese-dependent peroxidase，MnP)、漆酶(laccase，Lac)，這3種酶都具有多種各自的同工酶，白腐真菌的降解能力與這些酶的產(chǎn)生密切相關(guān)。而Pasti等[2]研究表明MnP單獨(dú)作用同樣可以降解多種不同類型的污染物。

MnP與LiP一樣，都是代表一系列具有糖基的胞外過氧化物酶，因二者都含有血紅素，又稱血紅素過氧化物酶。相對(duì)于其它過氧化物酶，MnP的特別之處在于它的底物是有機(jī)酸。MnP可以氧化Mn2+為Mn3+，而Mn3+可以螯合有機(jī)酸，這種螯合物可通過擴(kuò)散離開酶活性中心，在過氧化氫存在時(shí)能氧化酚型木質(zhì)素及木質(zhì)素模型物，即由 Mn2+及一種螯合物催化木質(zhì)素發(fā)生降解。MnP對(duì)木質(zhì)素的降解有賴于大量穩(wěn)定的Mn3+的存在，與其它酶一起能把木質(zhì)素徹底降解為二氧化碳[3-4]。

近年來，直接應(yīng)用MnP解決環(huán)境污染問題逐漸受到人們的關(guān)注，而提高M(jìn)nP的合成水平及其酶活性表達(dá)是強(qiáng)化白腐真菌對(duì)難降解有機(jī)物降解作用的關(guān)鍵所在。

由于黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium，以下簡(jiǎn)稱P.c.菌)具有十分強(qiáng)烈的降解木質(zhì)素的能力，因此以其作為研究對(duì)象，通過研究P.c.菌搖瓶培養(yǎng)體系在藜蘆醇、苯甲醇、吐溫80以及不同的金屬陽離子等活性因子的影響下的生長(zhǎng)及MnP酶活的變化規(guī)律，以確定該菌合成MnP的最優(yōu)條件，為研究P.c.菌產(chǎn)MnP提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1　菌種、試劑與儀器

P.c.菌(5.776)，廣州微生物菌種保藏中心。

藜蘆醇、吐溫80、苯甲醇、MgSO4·7H2O、CuSO4、CaCl2等均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠。

YXQ-LS-30S11型立式壓力蒸汽滅菌器、THZ-92B型氣浴恒溫振蕩器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LRH-150B型培養(yǎng)箱，廣東醫(yī)療器械廠；800型離心機(jī)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2　培養(yǎng)基

馬鈴薯固體培養(yǎng)基(用于繼代培養(yǎng))：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO43 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、硫胺素8 mg·L-1、瓊脂18 g·L-1。

馬鈴薯液體培養(yǎng)基(用于制備孢子懸浮液)：除不加瓊脂外，成分同馬鈴薯固體培養(yǎng)基。

液體限氮培養(yǎng)基[5](用于產(chǎn)酶反應(yīng)體系)：每升液體培養(yǎng)基中含0.2 g KH2PO4、0.05 g MgSO4·7H2O、0.01 g CaCl2、10 g葡萄糖、1 mg VB1、1 mL無機(jī)溶液、1.2 mmol酒石酸銨，其中無機(jī)溶液組分及含量見表1。

表1　液體限氮培養(yǎng)基中無機(jī)溶液的組分及含量/(mg·L-1)

1.3　化學(xué)試劑及金屬離子對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及MnP酶活的影響[6-7]

將斜面上的菌種接種到馬鈴薯固體培養(yǎng)基平板上于30 ℃下培養(yǎng)7～8 d。用馬鈴薯液體培養(yǎng)基配制孢子懸浮液。

取30 mL液體限氮培養(yǎng)基加入250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌30 min后接入3 mL孢子懸浮液，分別加入不同濃度的藜蘆醇、苯甲醇、吐溫80及Ca2+、Fe2+、Cu2+等活性因子，于30 ℃、160 r·min-1的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，反應(yīng)液于3 000 r·min-1下離心10 min，取上清液即為粗酶液。 測(cè)定體系中P.c.菌的生物量及MnP 酶活。以不加活性因子的產(chǎn)酶體系為對(duì)照。

1.4　分析測(cè)試

1.4.1生物量的測(cè)定

采用細(xì)胞干重法[8]。

1.4.2MnP酶活的測(cè)定

取去離子水1 mL、1 mmol·L-1的MnSO4溶液0.4 mL、酒石酸/酒石酸鈉緩沖溶液(pH值5.0) 1.2 mL、粗酶液1 mL，最后加入1 mmol·L-1的過氧化氫溶液(現(xiàn)配)0.4 mL啟動(dòng)反應(yīng)，用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)混合液在238 nm處3 min內(nèi)吸光度值的變化。

MnP酶活定義為：1 min內(nèi)氧化1 μmol Mn2+所需的酶量為一個(gè)酶活單位(1 U)[9]。

2　結(jié)果與討論

2.1　藜蘆醇濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

改變產(chǎn)酶體系的藜蘆醇濃度分別為0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-1，測(cè)定產(chǎn)酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結(jié)果見圖1。

圖1　藜蘆醇濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

由圖1可知，在藜蘆醇濃度為0～200 mg·L-1時(shí)，可以促進(jìn)P.c.菌生長(zhǎng)，隨著藜蘆醇濃度的增大，菌生物量增加；在濃度為150 mg·L-1時(shí)，菌生物量達(dá)到最大，為0.0751 g；之后隨著藜蘆醇濃度增大菌生物量降低，在濃度達(dá)到250 mg·L-1時(shí)低于對(duì)照組。而較低濃度的藜蘆醇(<10 mg·L-1)對(duì)MnP酶活沒有促進(jìn)作用；之后隨著藜蘆醇濃度的增大,MnP酶活增大，在濃度為150 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，為406.12 U·L-1，約為對(duì)照組的2倍；濃度繼續(xù)增大到250 mg·L-1時(shí)，MnP酶活比對(duì)照組小，表明此時(shí)對(duì)產(chǎn)酶起抑制作用。由菌生物量及MnP酶活可知，藜蘆醇濃度小于200 mg·L-1時(shí)對(duì)P.c.菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)錳過氧化物酶效果較好。藜蘆醇學(xué)名 “3,4-二甲氧基苯甲醇”，在該產(chǎn)酶體系中是P.c.菌在次生代謝階段自身合成并分泌到胞外的活性因子，主要作用是作為還原底物誘導(dǎo)MnP的合成。所以在反應(yīng)體系中添加一定量的藜蘆醇，對(duì)提高M(jìn)nP酶活是有利的[10-11]。

2.2　苯甲醇濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

改變產(chǎn)酶體系的苯甲醇濃度分別為0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、150 mg·L-1、200 mg·L-1、250 mg·L-1，測(cè)定產(chǎn)酶培養(yǎng)后的生物量及MnP酶活，結(jié)果見圖2。

圖2　苯甲醇濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

由圖2可知，隨著苯甲醇濃度的增大，菌生物量及MnP酶活均增大，在苯甲醇濃度為150 mg·L-1時(shí)，菌生物量及MnP酶活均達(dá)到最大；之后隨著苯甲醇濃度的增大，菌生物量及MnP酶活呈下降趨勢(shì)，說明高濃度的苯甲醇會(huì)抑制MnP酶的產(chǎn)生；當(dāng)苯甲醇濃度達(dá)到250 mg·L-1時(shí)，MnP酶活低于對(duì)照組。苯甲醇具有與藜蘆醇相似的結(jié)構(gòu)，可以在一定程度上替代藜蘆醇作為誘導(dǎo)劑，促進(jìn)P.c.菌產(chǎn)酶。

2.3　吐溫80濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

改變產(chǎn)酶體系的吐溫80濃度分別為0 mg·L-1、1.4 mg·L-1、2.8 mg·L-1、7 mg·L-1、14 mg·L-1、28 mg·L-1、42 mg·L-1，測(cè)定產(chǎn)酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結(jié)果見圖3。

圖3　吐溫80濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

由圖3可知，在低濃度條件下，隨著吐溫80濃度的增大，菌生物量及MnP酶活均顯著增大；在吐溫80濃度為7 mg·L-1時(shí)菌生物量達(dá)到最大，為0.0872 g，之后隨著吐溫80濃度的增大而顯著減小，在28 mg·L-1時(shí)低于對(duì)照組；而MnP酶活則在吐溫80濃度為14 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，為490.72 U·L-1，之后隨著吐溫80濃度的增大，酶活略有下降，總體變化不明顯。吐溫80是非離子型的表面活性劑，濃度較低時(shí)，可提高微生物細(xì)胞膜的滲透性[12]，促使細(xì)胞內(nèi)的酶透過細(xì)胞膜分泌出來，有利于酶的合成。吐溫80對(duì)MnP酶活的影響主要體現(xiàn)在基團(tuán)對(duì)酶的吸附上，當(dāng)吐溫80濃度大于臨界膠束濃度(14 mg·L-1)后，形成的膠束對(duì)酶具有吸附作用，可能對(duì)MnP酶活產(chǎn)生了抑制[13]。

2.4　Ca2+濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

改變產(chǎn)酶體系的Ca2+濃度分別為0 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1、20 mg·L-1、25 mg·L-1、30 mg·L-1、35 mg·L-1，測(cè)定產(chǎn)酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結(jié)果見圖4。

圖4　Ca2+濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

由圖4可知， Ca2+濃度對(duì)P.c.菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活有很大的影響,隨著Ca2+濃度的增大，菌生物量和MnP酶活增大；在Ca2+濃度為25 mg·L-1時(shí),兩者均達(dá)到最大，分別為0.0531 g和701.48 U·L-1；之后隨著Ca2+濃度的增大，菌生物量及MnP酶活減小，但是總體呈促進(jìn)作用。Ca2+是微生物生長(zhǎng)所必需的元素，能有效防止MnP發(fā)生熱失活，有利于菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。但是高濃度Ca2+可能會(huì)與真菌相互作用，引起菌生理過程的變化，從而抑制其生長(zhǎng)。

2.5　Fe2+濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

改變產(chǎn)酶體系的Fe2+濃度分別為0 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、6 mg·L-1、8 mg·L-1、10 mg·L-1、12 mg·L-1、14 mg·L-1，測(cè)定產(chǎn)酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結(jié)果見圖5。

圖5　Fe2+濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

由圖5可知，F(xiàn)e2+的添加有效地促進(jìn)了P.c.菌的生長(zhǎng)及MnP酶活；在Fe2+濃度低于8 mg·L-1時(shí)，菌生物量及MnP酶活均隨著Fe2+濃度的增大而增大；在Fe2+濃度為6～8 mg·L-1時(shí)的產(chǎn)酶效果較好,菌生物量達(dá)到0.1026 g，MnP酶活達(dá)到646.1 U·L-1；當(dāng)Fe2+濃度大于8 mg·L-1后，菌生物量及MnP酶活隨著Fe2+濃度的增大而減小，當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到14 mg·L-1時(shí)均低于對(duì)照組。由此可見，F(xiàn)e2+在P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP方面具有很重要的作用。

2.6　Cu2+濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

改變產(chǎn)酶體系的Cu2+濃度分別為0 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.6 mg·L-1、0.7 mg·L-1，測(cè)定產(chǎn)酶培養(yǎng)后的菌生物量及MnP酶活，結(jié)果見圖6。

圖6　Cu2+濃度對(duì)P.c.菌生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活的影響

由圖6可知，隨Cu2+濃度的增大，菌生物量及MnP酶活均增大；在濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，菌生物量及MnP酶活均達(dá)到最大，分別為0.0546 g和701.48 U·L-1，說明低濃度Cu2+可以顯著促進(jìn)P.c.菌的生長(zhǎng)及MnP酶活；而當(dāng)Cu2+濃度超過0.2 mg·L-1后，菌生物量及MnP酶活呈明顯下降趨勢(shì)；當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到0.4 mg·L-1時(shí)，菌生物量及產(chǎn)MnP酶活已經(jīng)低于對(duì)照組，說明該濃度下Cu2+已對(duì)菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP酶活產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這可能是由于Cu2+的重金屬作用引起的。重金屬離子會(huì)對(duì)微生物起毒害作用，可使蛋白質(zhì)變性，且毒害作用在重金屬離子濃度較高時(shí)尤為明顯，所以Cu2+濃度越高，毒害作用越嚴(yán)重，使酶幾乎失活[14]。

3　結(jié)論

(1)藜蘆醇、苯甲醇和吐溫80的添加有利于白腐真菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)MnP：藜蘆醇在濃度為150 mg·L-1、苯甲醇在濃度為150 mg·L-1、吐溫80在濃度為14 mg·L-1時(shí)對(duì)MnP酶活的促進(jìn)作用最好。

(2)Ca2+、Fe2+對(duì)白腐真菌的生長(zhǎng)及MnP酶活的影響是一致的，表現(xiàn)為“先促進(jìn)，后抑制”的作用。

(3) Cu2+對(duì)白腐真菌的生長(zhǎng)及MnP酶活的抑制作用較明顯，僅在濃度小于0.4 mg·L-1時(shí)略微促進(jìn)酶活，大于該濃度均表現(xiàn)為抑制作用。

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