薛蛟，王英平，肖盛元，※

(1．北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081；2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)

人參是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值[1]。2013年，吉林省人參產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達(dá)330億元人民幣。與此同時，由于參地輪作周期較長，世界范圍內(nèi)可用參地面積越來越少。以吉林省集安市為例，1988年，全市人參種植面積1330萬m2，2005年縮減到480萬m2，2012年為470萬m2。相應(yīng)地，近5年，人參價格上漲了近10倍。

人參皂苷含量和組成是人參品質(zhì)的重要指標(biāo)?？拱┗钚猿煞秩藚⒃碥誖g3[2]已經(jīng)于2000年批準(zhǔn)為一類新藥；人參皂苷Rg1和Re被命名為“血管生長因子”[3，4]。隨著老齡化人口增加和疾病譜的改變(如腫瘤、肥胖和心血管疾病人口增加)，人參的需求量將會進(jìn)一步提高，人參及人參皂苷的需求量將會進(jìn)一步增加，供需矛盾將會進(jìn)一步加劇。培育人參皂苷高含量的人參新品種或者建立皂苷產(chǎn)量高的人參培養(yǎng)物培養(yǎng)技術(shù)是解決這種供需矛盾的關(guān)鍵基礎(chǔ)。本文總結(jié)了近年來在人參生物合成及其代謝調(diào)控方面的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步開展與人參皂苷合成和積累相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)研究；為闡明人參皂苷合成和積累的分子機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制提供參考；為通過基因工程手段建立高產(chǎn)人參皂苷細(xì)胞株和發(fā)酵技術(shù)提供理論依據(jù)并積累有關(guān)的基礎(chǔ)資料[5]。

1 人參皂苷生物合成相關(guān)基因研究進(jìn)展

闡明人參皂苷生物合成過程以及參與該過程的基因是人參系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。通過測定人參不同組織的EST序列(Expressed Sequence Tag)可以獲得人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中可以篩選某一功能超基因家族基因的mRNA[6]，通過構(gòu)建這些基因的表達(dá)載體或RNAi技術(shù)可以進(jìn)一步研究這些基因的功能。NCBI的EST數(shù)據(jù)庫收錄了22 884條人參屬植物的EST(其中，人參17 773條、西洋參5018條、三七93條)。人參皂苷生物合成過程及參與這些過程的基因見圖1。

HMGR.3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶[7，8]；PnMVK1.甲羥戊酸激酶[9]；PnSE1、PnSE2.鯊烯環(huán)氧酶[10～14]；DDS.達(dá)瑪烯二醇合成酶[15，16]；CYP716A47.原人參二醇合成酶[6]；CYP716A53v2.原人參三醇合成酶[17]；β-AS.β-香樹素合成酶[18，19]；CYP716A52v2.β-香樹素C28位羧基化酶[20]；PnUGT1.β-香樹素糖基化酶[21]

MHGR.They are methylhydroxyglutaryl CoA reductase;PnMVK1.mevalonate kinase;PnSE1,PnSE2.oxidosqualene cyclase;DDS.dammarendiol synthetase;CYP716A47.protopanoxadiol synthetase;CYP716A53v2.protopanoxatriol synthetase;β-AS.β-amyrin synthetase;CYP716A52v2.β-amyrin C28 oxidase;PnUGT1.β-amyrin UDP glycosyl transferase.

圖1人參皂苷生物合成過程及參與這些過程的基因

Fig.1Ginsenosidebiosyntheticpathwayandthefunctionalgenesinvolvedinthispathway

2 不同組織中人參皂苷生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平研究

人參屬植物不同組織部位皂苷含量差異較大。其中，人參莖中皂苷含量最低，約為人參根中皂苷含量的1/12；葉中含量最高，約為根中皂苷含量的2倍。通過測定人參皂苷生物合成相關(guān)基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平，可以分析人參皂苷生物合成部位和分布、積累的調(diào)控機(jī)制，人參皂苷生物合成相關(guān)基因表達(dá)水平是影響人參皂苷生物合成的關(guān)鍵因素。人參、三七和西洋參中參與三萜生物合成的基因在根、莖、葉中表達(dá)水平與這些組織中皂苷含量不顯示依賴關(guān)系，原因可能有2個方面。第一，這些基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平可能差異較大。基因轉(zhuǎn)錄水平高的組織中，相應(yīng)的蛋白質(zhì)翻譯和活化水平不一定高，而蛋白質(zhì)才是生理功能的直接執(zhí)行者。研究表明，生物組織中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與相應(yīng)蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性不好[22，23]。Nam，M.H等[24]采用2-DE MALDI TOF/LC ESI MS/MS(Two Dimensional Electrophoresis Matrix Assistant Leaser Dissociation Ionization Time of Flight Coupled Liquid Chromatography Tandem Electrospray Mass Spectrometry)方法從人參葉中鑒定了147個受光照調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，其中就有30個蛋白質(zhì)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平很低，采用EST測序方法未檢測到mRNA。第二，可能是植物組織內(nèi)存在皂苷重新分布和積累的調(diào)控機(jī)制。人參皂苷具有表面活性，可與膜結(jié)構(gòu)中的甾醇類物質(zhì)結(jié)合形成沉淀導(dǎo)致生物膜破壞[25]，從而產(chǎn)生一定的自毒作用[26，27]，這可能是未分化的人參組織中皂苷含量較低的重要原因之一。人參皂苷在組織中積累達(dá)到一定含量必須克服這種自毒作用。Yokota S.等[28]采用膠體金標(biāo)記人參皂苷Rb1的單克隆抗體，然后用電子顯微鏡分析觀察人參組織中金顆粒的分布，結(jié)果表明，人參根和莖中人參皂苷Rb1主要與蛋白質(zhì)顆粒結(jié)合并存在于細(xì)胞質(zhì)和液泡中，人參葉細(xì)胞的液泡和線粒體中皂苷含量很低，主要以游離態(tài)的形式富集于葉肉細(xì)胞的葉綠體和過氧化物酶體中。與蛋白質(zhì)結(jié)合和膜結(jié)構(gòu)包裹(液泡、葉綠體和過氧化物酶體等)等機(jī)制降低了人參皂苷的毒性作用，這可能是人參皂苷在組織中積累的調(diào)控機(jī)制之一(表1)。

表1人參皂苷合成相關(guān)基因在不同組織中的相對表達(dá)水平

Table 1Transcriptional level of ginsenoside biosynthetic genes in different organs

注：*.數(shù)據(jù)系根據(jù)相應(yīng)的文獻(xiàn)中柱形圖估算而得，以根中的表達(dá)水平為基準(zhǔn)(=1)，其余組織中的轉(zhuǎn)錄水平為比值；/.沒有此項(xiàng)數(shù)據(jù)。

Note:*.The data was derived from the graphs in the literature.The relative transcription levels in different was calculated with the transcription level in the root as reference(=1);/.means the transcription of this gene was not measured.

3 人參皂苷表達(dá)調(diào)控研究(表2)

毫無疑問，直接參與人參皂苷生物合成的酶類對人參皂苷生物合成至關(guān)重要，Han J.Y.等[13]采用RNA干擾方法使人參發(fā)根中達(dá)瑪烷合成酶沉默，人參皂苷含量降低至約原來的1/10。由于參與人參皂苷生物合成過程的功能基因研究還處于初步階段，通過導(dǎo)入人參皂苷相關(guān)合成基因提高皂苷含量的研究還沒有大量開展，Lee M.H.等構(gòu)建了鯊烯合成酶高表達(dá)的人參發(fā)根，但人參皂苷含量沒有本質(zhì)的提高，與外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑茉莉酸甲酯的效果相當(dāng)。另外，添加化學(xué)調(diào)節(jié)劑或者皂苷生物合成中間產(chǎn)物也可以在一定程度上提高人參培養(yǎng)物的皂苷含量。

表2人參皂苷生物合成和積累調(diào)控研究

Table 2Studies on ginsenoside biosynthetic regulation

續(xù)表2

植物材料Plant處理方法Treatment皂苷含量變化Variationofginsenosidecontent備 注Notes文 獻(xiàn)Reference人參懸浮細(xì)胞CellsuspensionofP．ginseng茉莉酸甲酯處理Methyljasmonatetreatment增加150%Increased150%[38]三七懸浮細(xì)胞CellsuspensionofP．notoginseng2-羥乙基茉莉酸酯處理2-hydroxylethyljasmonatetreatment增加60%Increased60%Rg1、Re、Rb1和Rd分別提高30%、30%、70%和110%ginsenosideRg1，Re，Rb1andRdincreased30%、30%、70%and110%respectively[39]人參發(fā)根HairyrootofP．ginseng細(xì)菌寡多糖處理Oligosaccharidetreatment增加100%Increased100%[40]人參懸浮細(xì)胞CellsuspensionofP．ginseng山梨醇處理Sorbitoltreatment增加45%～50%Increased45%-50%[41]人參懸浮細(xì)胞CellsuspensionofP．ginseng甲羥戊酸處理Mevalonicacidtreatment增加38%Increased38%早期添加主要影響人參皂苷Rb1的合成，晚期添加主要影響人參皂苷Rg1的合成MVAaddedinearlylogphasewaspredominantlyincorporatedintoginsenosideRb1，whileMVAaddedinlatelogphasewaspredominantlyincor?poratedintoginsenosideRg1．[42]

4 三萜類化合物生物合成相關(guān)功能基因研究方法(表3)

三萜類化合物是重要的藥用活性成分，其生物合成相關(guān)的功能基因研究是調(diào)控這些化學(xué)成分生物合成和積累的重要理論依據(jù)。由表3可以看出，功能基因研究首先需要篩選這一生理功能的候選基因，然后通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體確證這些基因的功能，因此候選基因的篩選是功能基因研究的關(guān)鍵。對于已經(jīng)完成基因組測序并且已經(jīng)建立基因共表達(dá)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的植物，可以根據(jù)基因共表達(dá)相關(guān)關(guān)系篩選某一功能基因共表達(dá)相關(guān)的特定功能基因，然后驗(yàn)證這些基因的功能，如蒺藜苜蓿的C24羥基化和C28氧化的基因研究；也可通過與親緣關(guān)系較近的植物相應(yīng)基因的同源性分析來篩選相關(guān)基因，如西紅柿乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的篩選；還可通過脅迫引起代謝組表達(dá)的變化，結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄水平變化的cDNA芯片分析結(jié)果篩選相關(guān)功能基因。對于沒有完成基因組測序的植物，EST測定結(jié)果是獲取功能基因序列的有效方法，通過同源性分析可以對這些表達(dá)序列進(jìn)行功能注釋，從而可以獲得某一功能的基因家族。根據(jù)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)合植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑數(shù)據(jù)庫，可以推測模式生物三萜類化合物生物合成相關(guān)功能基因，通過同源性分析可以從轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果中篩選相關(guān)功能基因的序列信息。

表3近年來關(guān)于三萜類化合物生物合成相關(guān)基因功能的研究

Table 3Researches on biosynthetic genes of triterpenoids

續(xù)表3

植物材料Plant基 因Gene功 能Function方 法Method文 獻(xiàn)Reference燕 麥ArrhenatherumelatiusCYP51H10合成12，13-epoxy-16-hy?droxy-amyrinSynthesisof12，13-epoxy-16-hydroxy-amyrin通過代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和變異植株的轉(zhuǎn)錄組分析，推測代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，篩選候選基因。通過克隆和轉(zhuǎn)基因酵母驗(yàn)證基因功能。Candidategenewasselectedfromtranscriptomeofvariant．Itsfunc?tionwasvalidatedwithtransgenicyeast．[50，51]葡萄藻BotryocladialeptopodaSSL(鯊烯合成酶類似基因，squaleneepoxidaselikegene)Botryococcene合成Synthesisofbotryococcene根據(jù)Botryococcene與鯊烯結(jié)構(gòu)相似的特點(diǎn)，推測存在催化FPP合成Botryococcene的鯊烯合成酶同源基因。通過葡萄藻cDNA文庫找到與鯊烯合成酶同源的基因。再通過克隆，酵母表達(dá)驗(yàn)證基因功能。Thebiosyntheticpathwayofbotryococcenewasblockedoutfromthatofsqualene．ThecandidategenewasselectedfromthecDNAlibraryofBotryocladialeptopoda．Itsfunctionwasvalidatedwithtransgenicyeast．[52，53]

(待續(xù))