楊玉霞，于秀華，劉競(jìng)研，趙雅蔚，姜秀艷， 鄭菊花，尹建元，趙蕓浩，李政

(1．吉林大學(xué)a．藥學(xué)院；b．化學(xué)院，長(zhǎng)春130012；2．東北師范大學(xué)附屬中學(xué)，長(zhǎng)春130021)

石菖蒲是天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖，具有芳香開(kāi)竅、醒神益智的功效[1]。其主要活性成分為石菖蒲揮發(fā)油，包括甲基丁香酚、α-細(xì)辛醚、β-細(xì)辛醚、γ-細(xì)辛醛等物質(zhì)[2]；當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelicasinesis(Oliv.)Diels]的干燥塊根，具有活血補(bǔ)血、補(bǔ)氣調(diào)經(jīng)等功效[3]。揮發(fā)油是其重要有效成分，主要有藁苯內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯等[4]。

中藥揮發(fā)油氣味特異，難溶于水，揮發(fā)性強(qiáng)，穩(wěn)定性差，對(duì)光敏感。β-環(huán)糊精(β-CD)具有環(huán)形筒狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部以氧原子為主，具有疏水性；外部以羥基為主，具有親水性[5]。β-環(huán)糊精在中藥制劑中常用于揮發(fā)油的包合，以增加其穩(wěn)定性。

目前已有石菖蒲、當(dāng)歸揮發(fā)油單獨(dú)提取及β-環(huán)糊精包合工藝研究報(bào)道[6，7]，但尚未見(jiàn)有關(guān)于石菖蒲、當(dāng)歸混合揮發(fā)油的提取及包合工藝的研究報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)石菖蒲、當(dāng)歸混合揮發(fā)油的提取方法、包合工藝條件及包合物驗(yàn)證方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究，以期獲得最佳提取方法及包合工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)；KDM型電子調(diào)溫電熱套(金壇市金祥龍電子有限公司)；ZK-820型真空干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)；SHB-ⅢA 型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)；CAMAG型薄層色譜掃描儀(瑞士CAMAG公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工集團(tuán))；Lambda 25 UV/VIS Spectrometer(美國(guó)Perkin-Elmer公司)；Nicolet iS5傅立葉變換紅外光譜儀(上海萊睿科學(xué)儀器有限公司)。

1.2試藥

石菖蒲、當(dāng)歸藥材均購(gòu)自長(zhǎng)春市仙草醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)吉林大學(xué)天然產(chǎn)物研究教研室尹建元教授鑒定為湖南產(chǎn)天南星科植物石菖蒲和甘肅產(chǎn)傘形科植物當(dāng)歸。β-環(huán)糊精(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1揮發(fā)油提取條件篩選

按處方設(shè)計(jì)稱(chēng)取石菖蒲、當(dāng)歸藥材共計(jì)100g，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法(甲法)提取，收集揮發(fā)油，用無(wú)水硫酸鈉脫水，得淡黃色的混合揮發(fā)油，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)影響揮發(fā)油得率的主要影響因素[8]，選擇藥材的粉碎度、提取時(shí)間和浸泡時(shí)間3個(gè)因素為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表L9(34)進(jìn)行試驗(yàn)，按設(shè)計(jì)條件測(cè)定揮發(fā)油提取率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3。

表1蒸餾工藝考察因素及水平表

Table1Thefactor-leveloforthogonaldesign

水平Level因素 Factor粉碎度AShatterdegrees提取時(shí)間B(h)Extractiontime浸泡時(shí)間C(h)Dippingtime1藥材飲片Medicinalslices4002粗粉10目Coarsepowder10Mu6053細(xì)粉40目Finepowder40Mu810

表2蒸餾工藝L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table2Orthogonaldesignandresultsofextractionprocedure

實(shí)驗(yàn)組Group因 素 FactorABCD提取率(%)Extractionratio111110750121222084553133308937421230787052231099256231210922731320772783213095729332109835K124893230982799527261K228717279522616027104K327134296942658926379R03824065960183500882

表3蒸餾工藝方差分析

Table3

Variance analysis of extraction procedure

注：F0.05(2，2)=19.00。Note:F0.05(2，2)=19.00.

由各表分析可知，各因素作用的主次為B>A>C(表2)。方差分析表明，B因素對(duì)揮發(fā)油的提取率影響顯著，A、C因素的影響不顯著(表3)。因此，可確定最佳提取工藝條件為A2B3C1，即藥材粉碎度粗粉10目、無(wú)需浸泡、提取時(shí)間8h。以上最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次得提取率分別為1.1533%、1.1051%、1.0984%，揮發(fā)油的平均提取率為1.1189%(n=3)，因此，確定該工藝為最佳提取條件。

2.2揮發(fā)油包合工藝篩選

2.2.1包合物的制備經(jīng)查閱文獻(xiàn)[5]，采用飽和水溶液法制備混合揮發(fā)油包合物，即取一定量β-CD，加蒸餾水適量配成飽和溶液，加入1mL混合揮發(fā)油(預(yù)先配成50%的無(wú)水乙醇溶液)，于磁力攪拌器上恒溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間，冷卻至室溫，置冰箱中冷藏24h，抽濾，用石油醚洗滌濾渣3次(每次10mL)，濾渣置真空干燥箱中50℃干燥4h，即得。

2.2.2包合物評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定取干燥包合物，置500mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300mL，采用揮發(fā)油測(cè)定法(中國(guó)藥典2010版一部附錄XD)收集揮發(fā)油，計(jì)算包合物的揮發(fā)油包合率[9]。同時(shí)，取混合揮發(fā)油1mL，置500mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300mL，收集揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油空白回收率為81%。

2.2.3正交試驗(yàn)優(yōu)選包合工藝條件經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇揮發(fā)油與β-CD的投料比、包合溫度、包合時(shí)間作為考察因素，以揮發(fā)油包合率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。所選因素水平及正交試驗(yàn)見(jiàn)表4、表5。

表4混合揮發(fā)油β-CD包合工藝因素水平

Table 4The factor-level table of orthogonal design

分析可知，各因素作用的主次為B>A>C(表5)。方差分析表明，B因素為顯著因素(表6)。因此，確定最佳包合工藝條件為A2B3C2，即混合揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比為1∶8、包合溫度為60℃、攪拌時(shí)間2h。以上最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次得包合率分別為80.28%、82.15%、82.08%，包合率平均達(dá)81.50%(n=3)，因此，確定該條件為最佳包合工藝。

表5混合揮發(fā)油β-CD包合工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

Table5Orthogonaldesignandresultsofinclusionprocedure

實(shí)驗(yàn)組Group因 素 FactorABCD包合率(%)Inclusionrate111114897212225875313337346421235126522315305623128112731324540832134944933217535K118118145631795317737K218543161241853618527K317019229931719117416R1524843013451111

2.3包合物的定性分析

2.3.1薄層色譜鑒別量取當(dāng)歸、石菖蒲及二者混合的揮發(fā)油各0.05mL，置于5mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。取包合物1g，共2份，一份加乙酸乙酯5mL，超聲處理30min，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為包合物供試品溶液Ⅳ；另一份加石油醚5mL，冷浸1h，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為包合物供試品溶液Ⅴ[10]。取β-CD 1g，按供試品溶液Ⅳ的方法制備陰性對(duì)照品溶液Ⅵ。吸取對(duì)照品溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ各2μL，吸取包合物供試品溶液Ⅳ、溶液Ⅴ及陰性對(duì)照品溶液Ⅵ各5μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(17∶3)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，置于365nm紫外光燈下檢視(圖1)。

表6混合揮發(fā)油β-CD包合工藝正交試驗(yàn)方差分析

Table 6Variance analysis of β-CD inclusion procedure

注：F0.05(2，2)=19.00。Note:F0.05(2，2)=19.00.

結(jié)果顯示，供試品溶液Ⅳ在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置具有相同的熒光斑點(diǎn)，而供試品溶液Ⅴ與陰性對(duì)照品溶液Ⅵ色譜中均未見(jiàn)任何斑點(diǎn)，表明當(dāng)歸、石菖蒲揮發(fā)油進(jìn)入了β-CD分子內(nèi)部，形成了新的包合物，而且β-CD對(duì)揮發(fā)油沒(méi)有干擾，包合前、后揮發(fā)油成分基本不變。

2.3.2紫外光譜分析量取β-CD、包合物各0.5g，加5mL乙酸乙酯，超聲30min，過(guò)濾，濾液置100mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，作為樣品1、樣品2。取石菖蒲、當(dāng)歸混合揮發(fā)油10mg，置100mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，作為樣品3。以乙酸乙酯為空白，在190nm～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描(圖2)。

結(jié)果顯示，β-CD的乙酸乙酯溶液無(wú)混合揮發(fā)油的特征吸收，而經(jīng)超聲破壞的包合物與混合揮發(fā)油顯示的吸收譜圖峰形一致，說(shuō)明混合揮發(fā)油-β-CD包合物已形成，包合前、后化學(xué)成分基本不變。

2.3.3紅外光譜分析分別取包合前、后的混合揮發(fā)油、β-CD、包合物作為樣品，采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜掃描(圖3)。在包合前揮發(fā)油圖譜中3440.66cm-1處為石菖蒲、當(dāng)歸2種揮發(fā)油的疊加吸收峰。石菖蒲揮發(fā)油化學(xué)成分較復(fù)雜，其在2932.80cm-1、1511.36cm-1、1213.94cm-1、1.07.47cm-1處有尖峰，當(dāng)歸揮發(fā)油在1767.21cm-1處有尖峰。

包合物的圖譜中觀察不到這些特征峰，證明包合過(guò)程中形成新物象。β-CD在3422.70cm-1處有寬峰，1029.24cm-1處有尖峰；包合物3422.70cm-1峰移至3400.36cm-1，峰變窄，1030.49cm-1處尖峰也變窄，說(shuō)明混合揮發(fā)油和環(huán)糊精之間產(chǎn)生作用。包合前、后的揮發(fā)油紅外圖譜比較說(shuō)明，包合前、后混合揮發(fā)油的主要化學(xué)成分未發(fā)生顯著變化。

3 討論

β-環(huán)糊精可選擇性地與多種芳香化合物形成環(huán)糊精包合物，它的包合作用在增加藥物的溶解度、穩(wěn)定性、掩蓋藥物的臭味等方面具有良好效果[11]。本實(shí)驗(yàn)利用β-環(huán)糊精對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行包合可有效減少揮發(fā)油在制劑生產(chǎn)貯存運(yùn)輸過(guò)程中受光線高溫的影響，明顯提高藥物制劑的穩(wěn)定性，改善藥物溶解度，提高生物利用度，促進(jìn)藥物療效的發(fā)揮。

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸汽蒸餾法提取石菖蒲、當(dāng)歸混合揮發(fā)油，得到最佳提取工藝，即將藥材粉碎為粗粉10目、無(wú)需浸泡、提取時(shí)間8h。本研究單獨(dú)提取當(dāng)歸、石菖蒲藥材的出油率分別為0.4357%、1.1316%，而混合揮發(fā)油提取率達(dá)到1.1189%，按處方量計(jì)算，混合提取比單獨(dú)提取出油率增加，還節(jié)省成本。因此，本研究采用混合提取揮發(fā)油的方法。

本實(shí)驗(yàn)采用飽和水溶液法得到最佳包合工藝，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比為1∶8、包合溫度60℃、攪拌時(shí)間2h。包合物包合率平均達(dá)81.50%(n=3)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明本工藝重現(xiàn)性好、質(zhì)量穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)采用薄層、紫外、紅外法對(duì)包合物的驗(yàn)證結(jié)果表明，包合前、后揮發(fā)油的主要化學(xué)成分未發(fā)生顯著變化，并且揮發(fā)油與β-環(huán)糊精形成新的穩(wěn)定化合物。

[1]李艷艷,姜志恒,尹建元.兩種石菖蒲揮發(fā)油主成分及其含量的比較[J].特產(chǎn)研究,2011,39(1):44-45.

[2]劉春海,劉西京,楊華生.石菖蒲揮發(fā)油的GC-MS分析[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,24(7):1280-1281.

[3]Chen J T,Yang C R.Researches in Angelica L[J].Nat Prod Res Dev,2004,16:359-365.

[4]李曦,張麗宏,王曉曉,等.當(dāng)歸化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材,2013,36(6):41-42.

[5]郝晶晶,李海亮,龔慕辛.揮發(fā)油環(huán)糊精包合技術(shù)的研究進(jìn)展及存在問(wèn)題分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(2):352-356.

[6]柯瑜,倪健,姚玨成.石菖蒲揮發(fā)油提取及包合工藝的優(yōu)選[J].中成藥,2006,28(9):1271-1274.

[7]李元波,殷輝安,周琳.當(dāng)歸揮發(fā)油的提取與β-環(huán)糊精包合工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2006,18(5):836-840.

[8]王曉麗,黃海濤,蔡德富.石菖蒲揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(2):169-172.

[9]陳秋實(shí),張洪,吳杰.薄荷揮發(fā)油的提取及其β-環(huán)糊精包合物制備工藝研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,31(1):13-16.

[10]杜帆,夏新華,趙碧清.環(huán)糊精包合桂枝、當(dāng)歸混合揮發(fā)油的工藝研究[J].中成藥,2012,34(8):1604-1606.

[11]左晶,劉文波.β-環(huán)糊精包合復(fù)方上感膠囊揮發(fā)油制備工藝的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(8):1551-1552.