章思思, 劉必謙, 周湘池, 宋麗青

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

酪氨酸酶(tyrosinase ,EC 1.14.18.1)在動(dòng)植物、微生物及人體中廣泛分布,是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基含銅氧化還原酶，來(lái)源于胚胎神經(jīng)細(xì)胞,也是目前唯一已明確的黑色素代謝酶[1]。它作為黑色素生成過(guò)程中的主要限速酶,具有單酚酶和二酚酶的活性,既可以作為酪氨酸羥化酶、多巴氧化酶,又可以作為5,6-二羥基吲哚氧化酶,其活性與黑色素的合成量成正相關(guān)[2-3]。若能有效及合理的對(duì)酪氨酸酶活性進(jìn)行抑制，對(duì)人類(lèi)的生產(chǎn)生活有許多方面的意義:利于食品保鮮、抗蟲(chóng)領(lǐng)域、黑色素瘤治療,此外酪氨酸酶在人腦神經(jīng)黑色素細(xì)胞傳遞多巴胺的過(guò)程中起著主導(dǎo)作用,此過(guò)程與帕金森病發(fā)生相關(guān)[4-6]。

氨基葡萄糖(Glucosamine，G-NH2)又稱(chēng)葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖,簡(jiǎn)稱(chēng)氨糖，是葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代后的化合物。氨基葡萄糖作為甲殼素的最終水解產(chǎn)物,是自然界含量最豐富的單糖之一。氨基葡萄糖幾乎分布于人體所有組織,參與構(gòu)造了人體組織和細(xì)胞膜，是蛋白多糖大分子合成的中間物質(zhì),它可合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖等[7]。工業(yè)上制取氨基葡萄糖一般采用水解甲殼類(lèi)動(dòng)物的外骨,對(duì)于氨基葡萄糖的應(yīng)用大多注重于骨關(guān)節(jié)炎領(lǐng)域，它還有其他方面的生理功能有待開(kāi)發(fā),如抗氧化性等[8]。本文研究了氨基葡萄糖(單糖)對(duì)酪氨酸酶活性的影響,探討其對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理,為有效開(kāi)發(fā)利用氨基葡萄糖酪氨酸酶抑制功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪氨酸酶購(gòu)自Chivington化學(xué)公司的蘑菇酪氨酸酶,L-多巴購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。氨基葡萄糖參照唐杰方法制備[9]，曲酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6型可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;DK-S22電熱恒溫水浴箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電子天平梅特勒-托利多公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酪氨酸酶活力的測(cè)定

以黃璜測(cè)定方法[10]為參照并作適當(dāng)?shù)男薷?。加?.2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH值6.5),以0.6 mL 10 mmol/L DOPA為底物,30℃水浴10 min,加0.2 mL 多酚氧化酶溶液 (250 U/mL)。讀取從混勻開(kāi)始5 min內(nèi)的A475, 以每分鐘A475增加0.001為1個(gè)酶活力單位,酶促反應(yīng)的速度用每分鐘A475增加值來(lái)表示。

1.3.2 G-NH2對(duì)酪氨酸酶抑制作用

在上述反應(yīng)液中加入不同濃度的G-NH2溶液50 μL,0.2 mL酶液(預(yù)熱后加),磷酸緩沖溶液補(bǔ)足反應(yīng)液的總體積為3 mL。測(cè)5 min內(nèi)A475的變化。按公式計(jì)算相對(duì)酶活力和酶抑制率[11]：

式中A1為無(wú)G-NH2溶液有底物DOPA時(shí)的吸光度;A2 為無(wú)G-NH2溶液無(wú)底物DOPA的吸光度;A3 為有G-NH2溶液與底物時(shí)的吸光度;A4 為有G-NH2溶液無(wú)底物時(shí)的吸光度。

1.3.3 不同質(zhì)量濃度的DOPA底物酶促反應(yīng)速度變化的測(cè)定

在3 mL反應(yīng)體系中改變G-NH2的濃度,底物DOPA濃度。使DOPA最終濃度分別0.500 mg/mL、0.550 mg/mL、0.625 mg/mL、0.720 mg/mL、0.833 mg/mL和1.000 mg/mL,測(cè)酶活力,得到5 min內(nèi)A475的變化。采取Lineweaver-Burk作圖,根據(jù)酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和表觀最大反應(yīng)速率Vm的變化分析G-NH2對(duì)酪氨酸酶抑制作用。

1.3.4 不同酶量對(duì)酶促反應(yīng)速度變化的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)要對(duì)酶量進(jìn)行控制,在3 mL體系中,DOPA不變,每個(gè)試管中的酶量不同,G-NH2濃度不同。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果吸光度值得的變化,算出不同時(shí)間段的酶反應(yīng)速率,以酶量為橫坐標(biāo),酶速率為縱坐標(biāo),作圖,并分析圖像。

2 結(jié)果

2.1 時(shí)間對(duì)酪氨酸酶酶促反應(yīng)的影響

酪氨酸酶促反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是,在酪氨酸酶的催化作用下,將L-DOPA轉(zhuǎn)化為紅色的多巴醌,而產(chǎn)物的量通過(guò)測(cè)定其在475 nm下的吸光度來(lái)定量判斷,而反應(yīng)速率表現(xiàn)為單位時(shí)間A475增加量。酪氨酸酶促反應(yīng)產(chǎn)物隨時(shí)間變化結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,隨時(shí)間延長(zhǎng),測(cè)得的A475增大,即反應(yīng)產(chǎn)物量增大,酶促反應(yīng)速率下降,越接近初速度越能反應(yīng)酶活力。但考慮到G-NH2對(duì)酪氨酸酶促反應(yīng)的作用復(fù)雜性,在酶促反應(yīng)的抑制作用判斷中,采取了5 min的反應(yīng)時(shí)間。

圖1 酪氨酸酶促反應(yīng)

2.2 G-NH2對(duì)酪氨酸酶促反應(yīng)的抑制作用

G-NH2對(duì)酶促反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。從圖2可以看出不同濃度G-NH2對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用,圖3是在此情況下的相對(duì)酶活力值。A值越小,產(chǎn)物多巴醌越少,酶促反應(yīng)抑制能力越好。隨G-NH2濃度增大,對(duì)酶抑制能力增強(qiáng),當(dāng)加入50 μL濃度為2.2 mg/mL時(shí)(體系中G-NH2終濃度為36 μg/mL), 酶的相對(duì)活性只有50%(酶抑制率為50%)。

G-NH2對(duì)酶的抑制過(guò)程很復(fù)雜,從圖2得出,G-NH2先促進(jìn)酶反應(yīng)速率,在60～90 s之間后轉(zhuǎn)變?yōu)橐种品磻?yīng)。抑制程度很強(qiáng),在120 s之后A475出現(xiàn)下降的現(xiàn)象,這說(shuō)明產(chǎn)物多巴醌的量有減少。為了體現(xiàn)整個(gè)反應(yīng)規(guī)律,延長(zhǎng)了反應(yīng)時(shí)間(見(jiàn)討論)。

圖2 不同濃度的G-NH2對(duì)酪氨酸酶促反應(yīng)的影響

圖3 在不同濃度G-NH2下的相對(duì)酶活力變化

2.3 不同底物濃度對(duì)酪氨酸酶促反應(yīng)的抑制作用

在一定濃度的G-NH2溶液中,保持反應(yīng)體系中酶量不變,改變底物L(fēng)-DOPA濃度,結(jié)果如圖4。圖4橫坐標(biāo)為底物L(fēng)-DOPA濃度的倒數(shù),縱坐標(biāo)為酶促反應(yīng)速率的倒數(shù),圖中直線截得橫坐標(biāo)截距為-1/Km,截得縱坐標(biāo)截距為1/G-NH2。由圖可得,隨著反應(yīng)體系中加入的G-NH2濃度增大,最大反應(yīng)速率G-NH2減小,但各條直線沒(méi)有共同交點(diǎn)。

圖4 G-NH2對(duì)酪氨酸酶催化氧化多巴抑制作用的Lineweaver-Burk曲線

若是典型單一化合物酶抑制劑(競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或混合型抑制劑)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖中,不同抑制劑質(zhì)量濃度的直線相交于一點(diǎn)[12]。若只有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,不論是一種還是兩種及以上,最大反應(yīng)速度Vm應(yīng)不變;若只有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,不論是一種還是兩種及以上,表觀米氏常數(shù)Km減小或不變[13-14]。圖4中各條直線在第二象限有交點(diǎn),有直線可算出橫坐標(biāo)的截距,計(jì)算結(jié)果Km變化規(guī)律不是單一的非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑;在不同濃度G-NH2反應(yīng)中最大反應(yīng)速度Vm也是不同的,故G-NH2對(duì)酪氨酸酶的抑制不是單一競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.4 不同酶量對(duì)酶促反應(yīng)速度變化的影響

跟上組數(shù)據(jù)處理類(lèi)似,固定底物DOPA濃度不變,在不同濃度的G-NH2中,改變加入的酶量,測(cè)定各酶促反應(yīng)的速率。以測(cè)得的酶反應(yīng)速率為縱坐標(biāo),加入的酶量為橫坐標(biāo),作圖得圖5。

圖5 G-NH2對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理曲線

觀察圖5可得,實(shí)驗(yàn)得到的是一組平行線,隨著G-NH2濃度的改變斜率基本不變,這說(shuō)明G-NH2對(duì)酶的抑制作用是一個(gè)不可逆的過(guò)程[15]。

3 討論

2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖是化學(xué)性質(zhì)很活潑的單糖,G-NH2對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,G-NH2對(duì)酪氨酸酶反應(yīng)是先促進(jìn)后抑制的;從酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)看,G-NH2對(duì)酪氨酸酶而言是混合抑制劑,抑制類(lèi)型是不可逆的。

3.1 關(guān)于氨基葡萄糖

本實(shí)驗(yàn)使用的氨基葡萄糖,不是其衍生物,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖6。中外文獻(xiàn)中提及和使用的氨基葡萄糖(glucosamine)基本上都是氨基葡萄糖的各種衍生物,如氨基葡萄糖鹽酸鹽、氨基葡萄糖硫酸鹽、乙酰氨基葡萄糖等[16-17]。

圖6 氨基葡萄糖分子結(jié)構(gòu)圖

3.2 酶抑制反應(yīng)時(shí)間

由于酶抑制過(guò)程的復(fù)雜性,在探討G-NH2對(duì)酪氨酸酶的抑制實(shí)驗(yàn)中,反應(yīng)時(shí)間必須確定合理。若是時(shí)間過(guò)短,不能體現(xiàn)G-NH2對(duì)酪氨酸酶的抑制性;若是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),雖然呈現(xiàn)出G-NH2的抑酶能力,但是酪氨酸酶活性受到影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠準(zhǔn)確。從圖1可知,酪氨酸酶活力在6 min前是較平穩(wěn)保持的,到了6 min開(kāi)始下降。研究G-NH2對(duì)酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)時(shí),多次預(yù)實(shí)驗(yàn)得到結(jié)論：反應(yīng)進(jìn)行90 s后,G-NH2的抑制能力很明顯,3 min后出現(xiàn)A475下降現(xiàn)象,并且隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)持續(xù)下降。在大量預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上,參考中外文獻(xiàn)中有關(guān)實(shí)驗(yàn)[18-19],綜合考慮影響實(shí)驗(yàn)的各個(gè)方面,確定了5 min的反應(yīng)時(shí)間。這樣在不影響酶活力的條件下,最大可能保證抑酶效果。

3.3 抑酶反應(yīng)先揚(yáng)后抑現(xiàn)象

G-NH2本身具有羰基和氨基,單一物質(zhì)就可以發(fā)生美拉德反應(yīng)[20],物質(zhì)在外觀上由白色變?yōu)榈S色,隨著時(shí)間延長(zhǎng),顏色逐漸加深,最后變?yōu)楹谏?。這種反應(yīng)對(duì)溫度特別敏感,溫度越高,反應(yīng)越快。在抑酶反應(yīng)的初期, G-NH2加入后,發(fā)生了美拉德褐變反應(yīng),使得測(cè)得的吸光度值比不含G-NH2的空白組大,表現(xiàn)為促進(jìn)了酶反應(yīng)速率。之后沒(méi)有反應(yīng)的G-NH2參與抑酶反應(yīng),自身褐變反應(yīng)停止,黑色素合成被影響,多巴醌降低,吸光度值變小。

3.4 氨基葡萄糖抑酶機(jī)理

圖7是酪氨酸酶催化氧化多巴的過(guò)程[21],結(jié)合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、酶反應(yīng)過(guò)程以及各個(gè)物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì),可以推測(cè)G-NH2對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)制為：

圖 7 酪氨酸酶催化氧化為多巴醌的過(guò)程

酪氨酸酶的活性中心是由兩個(gè)含銅離子位點(diǎn)構(gòu)成。 在催化過(guò)程中,雙核銅離子位點(diǎn)以3種形態(tài)存在,分別是：還原型( Emet) 、氧化型( Eoxy) 和脫氧型( Edeoxy)[22]。董麗研究了氨基葡萄糖對(duì)銅金屬離子的作用性能,證明了G-NH2具有螯合金屬離子的作用,氨基葡萄糖能與銅離子1∶1配位[23]。在酪氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)中,G-NH2與酪氨酸酶活性中心上的雙核銅離子鰲合,使酪氨酸酶失去活性。

D-氨基葡萄糖分子(G-NH2)中含有-OH和-NH2活性位點(diǎn),從酶學(xué)的角度看含羥基類(lèi)化合物對(duì)酪氨酸酶有抑制作用。因?yàn)槔野彼崦傅幕钚灾行牡沫h(huán)境是疏水的,與 Eoxy中雙氧結(jié)合的質(zhì)子只能來(lái)自于酪氨酸和多巴分子中的羥基,因此酪氨酸和多巴與 Eoxy必需以HA酸的形式結(jié)合。實(shí)驗(yàn)證明,同一種酸HA在其它條件不變的情況下,它的抑制作用隨pH值的增大而減弱[24]。氨基葡萄糖通過(guò)與酪氨酸和多巴競(jìng)爭(zhēng)Eoxy和Emet把一部分酪氨酸酶從黑色素合成的催化環(huán)中帶走,降低酪氨酸酶在其中的濃度,從而抑制黑色素的合成[25]。

當(dāng)反應(yīng)到達(dá)了第3個(gè)階段,A475減少證明生成的紅色多巴醌的量減少。由圖7可知,多巴醌的氧化性很強(qiáng),這就能使溶液中存在的氨基葡萄糖還原多巴醌,因而會(huì)出現(xiàn)吸光度值減少的現(xiàn)象[26]。

本實(shí)驗(yàn)表明,氨基葡萄糖具有較好的酪氨酸酶抑制功能,加上其無(wú)毒、容易被細(xì)胞和皮膚吸收等特性,具有開(kāi)發(fā)美白護(hù)膚產(chǎn)品的潛力。

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