馮 潛， 劉祖碧， 宋 濤， 焦林濤， 陳勝華， 周嘉裕， 廖 海

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

決明子(Semencassiae)為豆科一年生植物大決明(CassiaobtusifoliaL.)或小決明(CassiatoraL.)的干燥成熟種子。決明子中含有多種有效成分，具有降血壓、降血脂、保肝及抑菌等生理活性[1]，是極具營養(yǎng)價(jià)值的保健食品，也是國家衛(wèi)生部公布的69種藥食同源的作物之一。蛋白質(zhì)是決明子的主要藥效成分之一，含有大量的人體必需氨基酸及微量元素[2]。與決明子的降壓保肝[3]、預(yù)防高血脂[4]、增強(qiáng)機(jī)體免疫及抗衰老等功能相關(guān)[5]。決明子中可大量提取的蛋白質(zhì)(p55)與人體載脂蛋白B具有相關(guān)性，可能通過參與體內(nèi)脂質(zhì)的代謝而起到降脂作用[6]。決明子中還存在具有抑制膽固醇合成作用的新蛋白PeakⅡ-3[7]。各類蛋白質(zhì)的氨基酸組成具有獨(dú)特的比例，所含的必需氨基酸組成比例越高，則其質(zhì)量就越優(yōu)。參照現(xiàn)有的決明子蛋白提取工藝[8]，本研究分析了四川產(chǎn)大決明(CassiaobtusifoliaL.)種子中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了蛋白質(zhì)的提取工藝，旨為開發(fā)利用甚至工業(yè)化提取決明子的營養(yǎng)蛋白，為發(fā)展決明子食療保健產(chǎn)品提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

相同大小、色澤、飽和度的成熟干燥四川產(chǎn)地決明種子(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院同一批次提供)。

粉碎機(jī)；80目篩；烘箱；電子天平(BS224S，Sartorius)；氨基酸分析儀(Elite-AAA，上海禾工儀器)；恒溫磁力攪拌器；離心機(jī)；透析袋；酶標(biāo)儀(Synergy H1，博騰儀器)；pH計(jì)；可見光分光光度計(jì)(V-1100d，上海美譜達(dá)儀器)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)；KH2PO4-NaOH緩沖溶液；晶狀粉末硫酸銨(分析純)；牛血清蛋白(BSA，Sigma)標(biāo)準(zhǔn)液濃度1.0 mg/mL，正己烷(分析純)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取方法

決明子于60℃烘箱干燥24 h后，用粉碎機(jī)粉碎并過80目篩。精確稱取決明子粉末10.0 g，60℃下使用正己烷回流脫脂，固液比為1 g∶20 mL，風(fēng)干后加入KH2PO4-NaOH提取緩沖液，于4～7℃下磁力攪拌提取。再在7℃、5000 r/min的條件下離心10 min。取上清液，并邊攪拌邊緩慢得往其中加入晶狀粉末硫酸銨至飽和。蛋白質(zhì)在8 h內(nèi)會(huì)達(dá)到最大析出量。于7℃、5000 r/min的條件下離心10 min分離出蛋白質(zhì)沉淀。沉淀置透析袋內(nèi)于4℃緩沖液中透析2次，每次36 h去除硫酸銨。最后12000 r/min條件下離心10 min，收集上清液備用。

1.3.2 氨基酸測(cè)定方法

決明子中氨基酸的含量測(cè)定參考國標(biāo)GB/T 5009.5—2003中食品蛋白質(zhì)的測(cè)定方法[9]。精確稱取濃縮蛋白樣品20.0 mg于特制水解管底部，加入6 mol/L鹽酸10 mL，真空封管后于(110±1)℃水解24 h，水解液冷卻后用氫氧化鈉中和至pH值4并定容至50 mL。利用Elite-AAA型氨基酸分析系統(tǒng)測(cè)定氨基酸組成及含量。

1.3.3 營養(yǎng)價(jià)值分析方法

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在1973年提出的關(guān)于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值的必需氨基酸模式[10]，分別按公式(1)、(2)和(3)來計(jì)算樣本氨基酸的比值RAA(Ratio of Amino Acid)[11]，氨基酸比值系數(shù)RC(ratio coefficient of amino acid)以及氨基酸的比值系數(shù)得分SRC[12]。根據(jù)氨基酸比值系數(shù)得分來判斷該植物營養(yǎng)價(jià)值的高低，越接近100表明營養(yǎng)價(jià)值越高。在式(1)中，待評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的某必需氨基酸的含量在WHO/FAO模式中均表示為每g蛋白質(zhì)中有多少mg必需氨基酸。

要進(jìn)一步解放思想，深化文藝人才工作體制改革，堅(jiān)持向用人主體放權(quán)，為人才松綁，創(chuàng)新人才激勵(lì)機(jī)制，形成有利于各類人才脫穎而出的制度環(huán)境。

(1)

(2)

(3)

1.3.4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.5 蛋白質(zhì)提取工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了考察不同單因素(固液比、緩沖液濃度、提取時(shí)間、pH值)對(duì)提取效果的影響，設(shè)計(jì)并順序考察如下實(shí)驗(yàn)方案：

1)分別以固液比為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，在緩沖液濃度為50 mmol/L，pH值7.0條件下提取12 h，考察不同固液比的提取效果；

2)分別以緩沖液濃度為25、50、100和200 mmol/L，在固液比為1∶50，pH值7.0的條件下提取12 h，考察不同緩沖液濃度的提取效果；

4)分別以緩沖液pH值7.0、8.0、9.0和10.0，在固液比為1∶50，緩沖液濃度為50 mmol/L的條件下提取12 h，考察緩沖液不同pH值的提取效果。

最后每個(gè)單因素選取3個(gè)最優(yōu)值進(jìn)行L9(34)(四因素三水平)正交。

2 結(jié)果與討論

2.1 決明子營養(yǎng)價(jià)值分析

實(shí)驗(yàn)大決明子中總蛋白質(zhì)的含量為21.00%。氨基酸總含量為19.66%，其中7種必需氨基酸總含量為6.92%，氨基酸總量占蛋白總量的93.62%。其中各必需氨基酸與氨基酸總量的比值為：纈氨酸0.96%、亮氨酸1.54%、異亮氨酸0.80%、蛋氨酸0.40%、苯丙氨酸0.99%、賴氨酸1.35%及蘇氨酸0.88%。各非必需氨基酸與氨基酸總量的比值為：丙氨酸0.95%、脯氨酸0.88%、甘氨酸1.02%、絲氨酸1.18%、胱氨酸0.25%、谷氨酸3.52%、天門冬氨酸2.24%、酪氨酸0.64%、組氨酸0.54%及精氨酸1.52%。色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺未返回?cái)?shù)據(jù)。氨基酸中含量最多的是谷氨酸和天門冬氨酸，分別為3.52%和2.24%。

根據(jù)式(1)、(2)和(3)計(jì)算出決明子的RAA， RC以及SRC。為了對(duì)決明子營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行較精確的綜合評(píng)價(jià)，選擇了其他富含食用蛋白的對(duì)照組，包括南瓜葉[14]、雞蛋[15]、大豆[16]、紫花苜蓿[17]。比較結(jié)果見表1，決明的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)分高于大豆、紫花苜蓿，與南瓜接近，略低于雞蛋。在其食用價(jià)值方面具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

表1 決明子蛋白的營養(yǎng)價(jià)值分析Table 1 The analysis on nutritive value of protein from Semen cassiae

2.2 決明子蛋白質(zhì)提取單因素分析及正交優(yōu)化方案

根據(jù)蛋白質(zhì)提取工藝設(shè)計(jì)，一共進(jìn)行了13組單因素考察實(shí)驗(yàn)。每組10 g過篩決明子粉末，所提取蛋白在測(cè)定吸光值后由回歸方程計(jì)算提取到的蛋白含量，該值與決明子中總蛋白含量為2.1 g的標(biāo)準(zhǔn)參考相比，可計(jì)算出每一組單因素考察實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)提取的相對(duì)效率。結(jié)果如表2，當(dāng)其他因素固定時(shí)，固液比最優(yōu)的3個(gè)為1∶50、1∶60、1∶70，緩沖液濃度最優(yōu)的3個(gè)為50、100和200， pH值最優(yōu)的3個(gè)為7、8和9，提取時(shí)間最優(yōu)的3個(gè)為12 h、18 h及24 h。分別將選取到的3個(gè)最優(yōu)固液比(A)、緩沖液濃度(B)、緩沖液pH(C)、及提取時(shí)間(D)進(jìn)行L9(34)四因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果如表3。

表2 決明子蛋白質(zhì)提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of single factor on protein extraction of fromSemen cassiae

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 3 The factor level of the orthogonality experiment

3 結(jié)論

在決明子蛋白的營養(yǎng)價(jià)值分析中，決明子的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)分高于大豆、紫花苜蓿，與南瓜接近，略低于雞蛋。表明決明子在作為藥物使用的同時(shí)，也能達(dá)到補(bǔ)充優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的的效果。在決明子蛋白的提取試驗(yàn)中，影響決明子蛋白提取率的因素順序依次為：緩沖液濃度>緩沖液pH>固液比>提取時(shí)間。通過正交試驗(yàn)獲得堿性緩沖液提取法提取決明子蛋白的最佳工藝條件為：料液比1 g∶50 mL，緩沖液濃度50 mmol/L，緩沖液pH值8.0，提取時(shí)間12 h。此條件下決明子蛋白提取率為93.3%。單因素實(shí)驗(yàn)顯示：在料液比1∶50的基礎(chǔ)上添加更多的提取液反而使提取率下降，可能是提取、濃縮等過程產(chǎn)生了物料損失；在12 h的基礎(chǔ)上延長提取時(shí)間使提取率下降，可能與蛋白質(zhì)體外降解有關(guān)。

表4 正交試驗(yàn)的直觀分析Table 4 The analysis on the orthogonal experiment

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