張 樂, 龐 濤, 夏新莉

(北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083)

轉(zhuǎn)基因植物中選用安全性標記基因代替?zhèn)鹘y(tǒng)的負向選擇標記基因受到許多研究者的關(guān)注。甘露糖正向篩選體系以甘露糖為篩選劑，磷酸甘露糖異構(gòu)酶(Phosphomannose isomerase， PMI)基因為標記基因進行篩選。甘露糖對植物沒有直接的毒害作用，它作為一種額外的糖源在己糖激酶的催化下轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，轉(zhuǎn)化細胞在PMI 的催化下，6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為可供植物細胞代謝的6-磷酸果糖，從而進入糖酵解途徑被細胞利用[1]。非轉(zhuǎn)化細胞由于沒有PMI 基因不能將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸果糖，造成植物體內(nèi)6-磷酸甘露糖大量積累，ATP 新陳代謝受阻，抑制糖酵解，植物生長受到抑制，從而區(qū)分轉(zhuǎn)化細胞與非轉(zhuǎn)化細胞。自從1998年Joersbo 等[2]將PMI/ 甘露糖陽性篩選系統(tǒng)用于甜菜轉(zhuǎn)基因植物篩選以來，現(xiàn)已應(yīng)用于甘蔗、擬南芥[3-4]等多種植物的遺傳轉(zhuǎn)化篩選。磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI)只存在于少數(shù)豆科植物中[5]，因而PMI 基因可以作為標記基因用于巨尾桉轉(zhuǎn)化篩選試驗中。

巨尾桉(Eucalyptusgranddis×E.uophylla)屬桃金娘科落葉喬木，巨桉和尾葉桉的雜交種[6-7]。本研究利用從大腸桿菌中克隆的PMI基因構(gòu)建了植物表達載體，建立甘露糖為篩選標記的甘露糖正向選擇體系，并在巨尾桉的遺傳轉(zhuǎn)化中進行了初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗所需巨尾桉組培苗由國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心提供。

參照GenBank 上公布的PMI 基因序列，通過PCR 從大腸桿菌中已成功克隆6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶(6-phosphomannose isomerase, PMI)基因，由作者實驗室保存。

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 菌株，植物表達載體pCAMBIA1301-PMI 由作者實驗室保存。

1.2 愈傷組織誘導和不定芽分化

MS 培養(yǎng)基作為愈傷誘導培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，選用TDZ與NAA設(shè)計不同濃度正交試驗，剪取長度約1 cm桉樹莖段接種于不同激素配比的愈傷誘導培養(yǎng)基，統(tǒng)計愈傷形成及芽分化情況。每種濃度培養(yǎng)分別進行3次重復。

1.3 生根培養(yǎng)

1/2 MS 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，選用NAA與IBA設(shè)計不同濃度正交試驗，將經(jīng)過分化培養(yǎng)生長健壯的無菌苗接種于培養(yǎng)基上誘導生根，進行生根率的統(tǒng)計分析。

1.4 甘露糖選擇壓的確定

遺傳轉(zhuǎn)化之前進行甘露糖敏感性測試，獲得最佳篩選濃度，以便確定巨尾桉對甘露糖的天然耐性。以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，甘露糖與蔗糖比例分設(shè)13 個梯度，觀察愈傷形成及出芽情況。

1.5 遺傳轉(zhuǎn)化

剪取滅菌后的巨尾桉莖段，接種于愈傷誘導培養(yǎng)基中，避光培養(yǎng)1 d；將菌體離心后懸浮，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的莖段浸于菌體懸浮液中25～30 min；侵染后的莖段接種至含有羧芐青霉素(Carbenicillin，Car)200 mg/L的甘露糖篩選培養(yǎng)基中，避光培養(yǎng)。

1.6 抗性轉(zhuǎn)化植株分子鑒定

經(jīng)CPR 法和PCR 檢測初步確定轉(zhuǎn)基因植株。CPR 檢測參照Boscariol 等[8]的方法；CTAB 法提取基因組DNA 進行PCR 檢測，設(shè)計引物：Ppmi-1：5′-GACTCTTGACCATGGATGCA-3′；Ppmi-2： 5′-CTTGAAG ATCTGAGGGTAAATTTC-3′。以質(zhì)粒DNA 為模板的PCR 擴增產(chǎn)物作為陽性對照，未轉(zhuǎn)化的擬南芥植株基因組DNA 為模板的PCR 擴增產(chǎn)物為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMI基因及序列分析

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的PMI基因序列設(shè)計引物，大腸桿菌基因組為PCR 擴增模板進行擴增反應(yīng)。PCR 擴增產(chǎn)物回收后與PMD18-T 載體連接，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切測序得到長度為1176 bp 的片段，編碼391個氨基酸殘基(圖1)。與NCBI 上GenBank 中發(fā)表的已知核苷酸序列進行同源性比對，只有1091 處堿基出現(xiàn)差異，同源性達到99.91%；氨基酸序列比對后，同源性達到100%[4]，該基因登錄號為DQ146721。

圖1 PMI基因堿基序列

2.2 愈傷誘導及出芽分化

以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)計不同激素配比的27種愈傷誘導培養(yǎng)基，30 d 后統(tǒng)計愈傷組織生長情況及芽分化情況(表1)。

由表1可知，TDZ 對巨尾桉的愈傷組織誘導具有顯著的影響，TDZ 濃度取0.5 mg/L最為適宜，過低濃度的TDZ 會使愈傷組織發(fā)紅，而過高濃度的TDZ 則導致芽分化率降低；NAA 對愈傷組織誘導影響不甚顯著，但適當濃度的NAA 會增加芽的分化率。最佳的愈傷誘導與分化出芽培養(yǎng)基為MS+TDZ0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L(圖2)。

2.3 生根培養(yǎng)

表1 不同濃度TDZ、NAA對愈傷誘導及分化的差異顯著性分析

注：(1)表中數(shù)據(jù)為10次重復平均值±標準差；(2)同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母不同者表示經(jīng)LSD 法檢驗差異極顯著，下同。

圖2 愈傷組織形成(A)與分化出芽情況(B)

生根是保證苗木移栽成活的重要程序，分化出的根系的類型、長度及質(zhì)量等均是影響移栽成活率的重要因素。以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)計9種生根培養(yǎng)基，30 d后觀察生根情況(表2)。

表2 不同濃度NAA、IBA對生根的差異顯著性分析

由表2可知，NAA及IBA對于巨尾桉芽的生根均具有顯著影響，隨著NAA濃度的升高，生根率逐漸降低，生根質(zhì)量亦逐漸變差，根也變得越來越短，說明低濃度的NAA對巨尾桉生根有促進作用，而濃度較高則會抑制生根；IBA對植株生根也具有明顯的促進作用，濃度過高時則會抑制根和無菌苗的生長。誘導巨尾桉芽生根的最佳培養(yǎng)基是1/2MS+NAA0.5 mg/L+IBA0.5 mg/L(圖3)。

圖3 巨尾桉生根情況

2.4 甘露糖選擇壓的確定

由表3 可知，在不添加甘露糖的培養(yǎng)基中，80% 誘導愈傷出現(xiàn)，芽分化情況良好；隨著甘露糖比例的逐漸增加，蔗糖含量減少，誘導愈傷率逐漸降低，但差異不明顯；芽分化能力較弱，出現(xiàn)生長緩慢乃至停滯現(xiàn)象；當甘露糖濃度達到11 g/L 時，愈傷組織誘導情況明顯變差，芽亦停止分化。只有當甘露糖濃度達到能夠完全抑制愈傷組織誘導的臨界水平，才能區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細胞，蔗糖與甘露糖比例定為19∶11。

2.5 遺傳轉(zhuǎn)化

巨尾桉莖段經(jīng)侵染后接種在含有Car 200 mg/L 的甘露糖篩選愈傷誘導培養(yǎng)基中，經(jīng)愈傷誘導，分化出芽，繼代培養(yǎng)至生根培養(yǎng)篩選后初步得到待測陽性植株。

表3 不同濃度甘露糖對巨尾桉愈傷形成的差異顯著性比較(LSD)

2.6 抗性轉(zhuǎn)化植株分子鑒定

2.6.1 氯酚紅(CPR)法檢測 選取46 株待測轉(zhuǎn)基因植株葉片用于顯色反應(yīng)，部分顯色圖(圖4)，經(jīng)CPR 法染色后出現(xiàn)黃色或桔紅色的有14 棵陽性株系，陽性率為34.78%。

1—非轉(zhuǎn)基因葉片；2-7—轉(zhuǎn)基因株系的葉片。

M—DNA Marker III；1—陰性對照(CK)；2-8—轉(zhuǎn)基因待測株系；9—陽性對照。

圖5轉(zhuǎn)基因巨尾桉PCR檢測結(jié)果

Fig 5 PCR analysis of transgenic plants

2.6.2 PCR 檢測 經(jīng)CPR 法篩選出的14 棵陽性株系，剪取少量葉片提取基因組DNA 并進行PCR 檢測，結(jié)果顯示12 棵植株出現(xiàn)大小相對應(yīng)的特異性條帶，遺傳轉(zhuǎn)化率達到26.09%，部分檢測結(jié)果(圖5)。

3 結(jié)論與討論

甘露糖正向篩選過程中，非轉(zhuǎn)化細胞只是出于碳饑餓狀態(tài)，不會出現(xiàn)壞死，促使轉(zhuǎn)化細胞快速生長，來達到篩選目的。不同植物對總碳源量的要求，以及所需的甘露糖篩選壓最適濃度都不盡相同。Negrotto 等[9]轉(zhuǎn)化玉米時篩選培養(yǎng)基中碳源的最佳組合為10 g/L 甘露糖+5 g/L 蔗糖；Lucca 等[10]轉(zhuǎn)化水稻時，在保持甘露糖濃度不變(30 g/L)的前提下，蔗糖濃度逐次遞減至5 g/L，轉(zhuǎn)化效率達到最優(yōu)；Todd 和Tague[11]轉(zhuǎn)化擬南芥時甘露糖濃度僅為2 mmol/L；Kim 等[12]辣椒轉(zhuǎn)化過程中碳源最佳組合為15 g/L 甘露糖+20 g/L 蔗糖；番茄AV6 轉(zhuǎn)化時[13]，30 g/L 蔗糖添加3 g/L 甘露糖。本實驗最終確定MS 培養(yǎng)基添加糖源蔗糖與甘露糖比例為19∶11，只有當甘露糖濃度達到能夠完全抑制愈傷組織誘導的臨界水平，才能區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細胞。甘露糖篩選濃度較低時，假陽性比例較大，篩選效果不明顯；而如果濃度過大又會抑制植物生長，此時適當比例的蔗糖會緩解甘露糖的抑制作用。

植物組織培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑至關(guān)重要。同時，不同種類生長素和細胞分裂素的組合比例以及它們的絕對濃度都能影響細胞生長和分化[14]。通過對愈傷組織誘導與出芽分化過程中外源植物激素TDZ 與NAA 以及生根過程中IBA 與NAA 的濃度配比的調(diào)整，確定最優(yōu)激素配比為TDZ0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L，生根過程中為NAA0.5 mg/L+IBA0.5 mg/L，優(yōu)化了巨尾桉組織培養(yǎng)與再生體系，愈傷形成及出芽率達到76.7%，生根率達到73.7%。

本研究首次將PMI/ 甘露糖篩選體系應(yīng)用于木本植物巨尾桉的遺傳轉(zhuǎn)化中，在以農(nóng)桿菌介導的巨尾桉遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選用適宜的甘露糖濃度篩選轉(zhuǎn)化植株，桉樹遺傳轉(zhuǎn)化的陽性率達到26.09%，有效解決桉樹基因工程育種中遺傳轉(zhuǎn)化率低的瓶頸障礙，應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻:

[1]Reed J, Privallel M, Powel L, et al. Phosphomannose isomerase: an efficient selectable marker for plant transformation[J]. In Vitro Cell Dev Boil Plant, 2001, 37(2): 127-132.

[2]Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, et al. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet[J]. Molecular Breeding, 1998, 4(2): 111-117.

[3]Jain M, Chengalrayan K, Abouzid A, et al. Prospecting the utility of a PMI/ mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane plants[J]. Plant Cell Rep, 2007, 26(5): 581-590.

[4]楊彩云, 尹偉倫, 夏新莉. 甘露糖正向篩選體系的建立及在擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J].分子植物育種, 2009, 6(7): 1120-1129.

[5]高世武, 闕友雄, 郭晉隆, 等. 甘露糖篩選系統(tǒng)的建立及在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用[J]. 熱帶作物學報, 2010, 31(5): 789-796.

[6]祁述雄. 中國桉樹[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2006.

[7]Prakash M G, Gurumurthi K. Genetic transformation and regeneration of transgenic plants from precultured cotyledon and hypocotyl explants ofEucalyptustereticornisSm using agrobacterium tumefaciens [J]. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 2009, 45(4): 429-434.

[8]Boscariol R L, Almeida W A B, Derbyshire M T V C, et al. The use of the PMI/ mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants[J]. Plant Cell Rep, 2003, 22(2): 122-128.

[9]Nerotto D, Jolley M, Beer S, et al. The use of phosphomannose isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants via agrobacterium transformation [J]. Plant Cell Reports, 2000, 19(8): 798-803.

[10]Lucca P, Ye X.D, Potrykus I. Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent[J]. Molecular Breeding, 2001, 7(1): 43-49.

[11]Todd R, Tague B W. Phosphomannose isomerase: a versatile selectable marker forArabidopsisthalianagerm-line transformation[J]. Plant Mol Biol Rep, 2001, 19(4): 307-319.

[12]Kim J Y, Jung M, Kim H S, et al. A new selection system for pepper regeneration by mannose[J]. Plant Biotechnol, 2002, l4(3): 129-134.

[13]岳建雄, 孟釗紅, 張煉輝, 等. 以甘露糖作為篩選劑的棉花遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 棉花學報, 2005, 17(1): 3-7.

[14]歐陽樂軍, 李瓊?cè)A, 黃真池, 等. 3種抗生素對尾巨桉愈傷組織誘導及植株再生的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報, 2012, 40(2): 79-84.