俞國偉， 魏 春， 張艷麗， 汪 釗

(浙江工業(yè)大學 生物與環(huán)境工程學院， 杭州 310000)

類胡蘿卜素(Carotenoids)是廣泛存在于自然界中的不溶于水的多烯色素，顏色呈黃色、橙紅色或紅色，由綠色植物和某些真菌、酵母、細菌等產生。其中大多數為 40 個碳原子左右近似對稱萜烯，主體結構單元是異戊二烯。飲食研究結果表明：類胡蘿卜素除具有轉化為維生素A的生物活性外，還具有預防癌癥和心血管疾病等多種生理功能[1-2]。2005年世界市場用于食品、化妝品、醫(yī)藥方面的類胡蘿卜素就達1.3億美元，其純的天然制品售價已達2000美元/kg[3]。

由于當今社會的消費者對于食品、藥品天然、無毒無害的品質的追求，化學法生產的類胡蘿卜素逐漸受到質疑，微生物發(fā)酵法生產類胡蘿卜素是該產品生產工藝的發(fā)展趨勢。然而，微生物體內的類胡蘿卜素積累量有其自身的代謝限制，且普遍偏低。因此，尋求廉價的農產品或其廢棄物作為微生物發(fā)酵的原料是非常重要的。

番茄渣是番茄醬生產工業(yè)的下腳料，主要由番茄皮和少量的番茄籽組成，其化學成分主要為原果膠。原果膠是果膠與纖維素形成的高聚物。若能用纖維素酶將番茄渣水解，則不僅能得到低分子糖類物質，還能得到游離果膠。

番茄渣作為發(fā)酵原料方面的可行性，前人做過許多探索，Avelino等人考查了不同濃度的纖維素酶添加量對番茄渣糖化效率的影響，發(fā)現番茄渣經過適當濃度的纖維素酶酶促水解后可以產生葡萄糖、果糖、木糖、纖維二塘等寡糖，其后利用番茄渣水解得到的漿液培養(yǎng)白地霉，得到了理想的效果[4]。Haddadin等人運用兩步發(fā)酵法，先將里氏木霉接種于番茄渣中，利用其生長過程中產生的纖維素酶水解番茄渣，使之糖化，而后再接種謝氏丙酸桿菌，發(fā)酵生產維生素B12，并對涉及發(fā)酵的多個因素做了組合優(yōu)化[5]。Hidalgo等人考查了巴斯德梭菌在番茄醬中生長并水解其中的尿苷生產尿嘧啶的相關特性[6]。Freixo等人考查了采絨革蓋菌直接利用番茄渣作為唯一碳源生長，并且同時生產漆酶和木聚糖酶。經過酶的分離純化與酶活性質研究，發(fā)現二者的比酶活和催化性能都很令人滿意[7]。

研究表明，番茄的果肉、果皮具有被微生物利用的潛在價值，尤其本研究所采用的菌種——膠紅酵母，具有同化果膠的能力，番茄渣經過纖維素酶酶促水解所得到的寡糖、果膠對于膠紅酵母而言都是很好的碳源。本研究擬采用番茄渣、豆粕作為膠紅酵母的碳源、氮源。將原材料預先用纖維素酶水解，目的在于將番茄渣、豆粕中的高分子原果膠、纖維素水解成為可被膠紅酵母利用營養(yǎng)物質，尤其對豆粕而言，其蛋白質會在纖維素結構破壞之后大量釋放出來，這樣可以提高膠紅酵母對豆粕氮源的利用率。

1 材料與方法

1.1 菌種

膠紅酵母野生型菌株RhodotorulamucilaginosaWZW003是本實驗室保藏的菌株。

1.2 試劑

蛋白胨的規(guī)格為BR，MgSO4·7H2O，NaOH，HCl，二甲基亞砜以及乙醚的規(guī)格皆為AR。

纖維素酶購自浙大百川生物食品技術有限公司。

豆粕購自浙江省衢州市柯城宏源飼料廠。

番茄渣由市售番茄自制得到，市售番茄購自杭州市下城區(qū)德勝農貿市場。

1.3 農產品原料酶解方法

稱取一定量的番茄渣和豆粕，再加入一定量的纖維素酶和50 mL水，將體系置于60℃下攪拌。

1.4 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

膠紅酵母液態(tài)培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基成分為：葡萄糖，45 g/L；蛋白胨，15 g/L；MgSO4·7H2O，6 g/L；用1 mol/L的NaOH溶液將pH值調整至5.0±0.1；裝入250 mL三角瓶，裝液量40 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基以農產品原料的酶解液為主，用1 mol/L的NaOH溶液或HCl溶液將pH調整至一定的數值；裝入250 mL三角瓶，裝液量50 mL。

各種培養(yǎng)基在接種前皆采用高壓蒸汽滅菌，121℃持續(xù)20 min。

先將膠紅酵母的試管斜面菌落接種至種子培養(yǎng)基，并將其置于搖床上，以30℃、150 r/min培養(yǎng)2 d；而后將種子培養(yǎng)基以10%(V)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，以相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3 d。

1.5 發(fā)酵液預處理方法

將發(fā)酵液倒入50 mL離心管中，以10000 r/min離心10 min，棄去上清液，將剩下的沉淀與離心管一同放入-18℃冰箱預凍，待其結冰后再放入-30℃凍干機中進行冷凍干燥，時間持續(xù)3 d。

1.6 類胡蘿卜素提取方法

取出凍干后的發(fā)酵液固形物(菌體與殘余的番茄渣、豆粕)，稱重并記錄。

色素提取方法參照文獻[8]，將發(fā)酵液固形物研磨成粉末，加入100 mL二甲基亞砜，60℃下攪拌提取色素，時間持續(xù)1 h。

色素萃取方法參照文獻[9]，量取30 mL色素-二甲基亞砜-固形物混合液，以10000 r/min離心10 min，而后，從中量取20 mL上清液，裝入分液漏斗中，再向其中加入40 mL乙醚，將漏斗上下顛倒數次，以促進傳質；而后靜置，待其分層，排出下層二甲基亞砜相，收集乙醚相；該萃取步驟需要重復數次，直至乙醚相在448 nm處的OD值在±0.005之內；對于特定的固形物樣品，匯集其所有的乙醚萃取液，用于下一步的分析。

1.7 總類胡蘿卜素分析方法

將紫外-可見分光光度計的波長調至448 nm，用純的乙醚調零，而后測定色素-乙醚混合液的OD值，并記錄。單位質量的固形物中的總類胡蘿卜素含量按如下公式計算：

其中，OD448nm為乙醚相在448 nm處的吸光值，V表示萃取結束后的乙醚相的總體積，A表示總類胡蘿卜素(近似當作反式β-胡蘿卜素作計算，如文獻[9]所述)在448 nm處的摩爾消光系數，取值為2659，P表示用于提取色素的固形物重量；n為換算因子，在本研究中，100 mL二甲基亞砜提取液中僅有20 mL用于下一步的色素萃取操作，因此換算因子取值為5。

單位體積發(fā)酵液中的總類胡蘿卜素產量和總類胡蘿卜素增量按如下兩個公式計算：

總類胡蘿卜素產量(mg/L)=發(fā)酵產物總類胡蘿卜素含量(mg/g固形物)×發(fā)酵產物固形物濃度(g/L)

總類胡蘿卜素增量(mg/L)=總類胡蘿卜素產量-番茄渣的總類胡蘿卜素含量(mg/g固形物)×番茄渣添加量(g/L)

2 結果與討論

2.1 逐步單因素優(yōu)化的結果

2.1.1 纖維素酶添加量的優(yōu)化

將番茄渣添加量、豆粕添加量、酶解時間、培養(yǎng)基初始pH值分別設定為30 g/L，10 g/L，24 h，5.0；不同批次的實驗中的纖維素酶添加量分別調整為2、4、6、8和10 g/L。

結果發(fā)現，當纖維素酶添加量為8 g/L時，總類胡蘿卜素的產量與增量皆最大，分別為2.32 mg/L和1.12 mg/L。如圖1所示。

圖1 纖維素酶添加量對膠紅酵母發(fā)酵液中的總類胡蘿卜素濃度的影響Fig 1 Effect of additive amount of cellulase on the total carotenoids concentration in the fermentation broth of Rhodotorula mucilaginosa

2.1.2 酶解時間的優(yōu)化

將番茄渣添加量、豆粕添加量、纖維素酶添加量、培養(yǎng)基初始pH值分別設定為30 g/L，10 g/L，8 g/L，5.0；不同批次的實驗中的酶解時間分別調整為12、24、36、48和60 h。

結果發(fā)現，當纖維素酶酶解時間為48 h時，總類胡蘿卜素的產量與增量皆最大，分別為3.44 mg/L和2.24 mg/L。如圖2所示。

2.1.3 番茄渣添加量的優(yōu)化

將豆粕添加量、纖維素酶添加量、酶解時間、培養(yǎng)基初始pH值分別設定為10 g/L，8 g/L，48 h，5.0；不同批次實驗中的番茄渣添加量分別為10、20、30、40和50 g/L。

結果發(fā)現，當番茄渣添加量為40 g/L時，總類胡蘿卜素的產量與增量皆最大，分別為4.54 mg/L和2.94 mg/L。如圖3所示。

圖3 酶解反應中的番茄渣添加量對膠紅酵母發(fā)酵液中的總類胡蘿卜素濃度的影響Fig 3 Effect of additive amount of tomato pomace in enzymatic hydrolysis reactions on the total carotenoids concentration in the fermentation broth of Rhodotorula mucilaginosa

圖4 酶解反應中的豆粕添加量對膠紅酵母發(fā)酵液中的總類胡蘿卜素濃度的影響Fig 4 Effect of additive amount of soybean meal in enzymatic hydrolysis reactions on the total carotenoids concentration in the fermentation broth of Rhodotorula mucilaginosa

2.1.4 豆粕添加量的優(yōu)化

將番茄渣添加量、纖維素酶添加量、酶解時間、培養(yǎng)基初始pH值分別設定為40 g/L，8 g/L，48 h，5.0；不同批次實驗中的豆粕添加量分別為10、20、30、40和50 g/L。

結果發(fā)現，當豆粕添加量為30 g/L時，總類胡蘿卜素的產量與增量皆最大，分別為4.34 mg/L和2.74 mg/L。如圖4所示。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值對膠紅酵母發(fā)酵液中的總類胡蘿卜素濃度的影響Fig 5 Effect of initial pH of fermentation media on the total carotenoids concentration in the fermentation broth of Rhodotorula mucilaginosa

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化

將番茄渣添加量、豆粕添加量、纖維素酶添加量、酶解時間分別設定為40 g/L，30 g/L，8 g/L，48 h；不同批次實驗中的初始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5和6.0。

結果發(fā)現，當培養(yǎng)基初始pH值被調整為4.5時，總類胡蘿卜素的產量與增量皆最大，分別為6.17 mg/L和4.57 mg/L。如圖5所示。

2.2 均勻設計及其結果

在上一階段的單因素實驗中，總共5個與發(fā)酵培養(yǎng)基總類胡蘿卜素產量和增量有重要關系因素，即番茄渣添加量、豆粕添加量、纖維素酶添加量、酶解時間以及發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別得到了優(yōu)化，至此，總類胡蘿卜素產量和增量都得到了很大提升；然而，單因素實驗忽略了各個因素之間的交互影響，若選用合適的組合優(yōu)化方法，則可以進一步考查在各因素同時變動的情況下的目標產量與因素之間的關系，并且使目標產量進一步提升?？紤]到膠紅酵母所適用的pH范圍很窄，不便于在組合優(yōu)化中設置多個水平，因此，在下一步的實驗中選擇其它4個因素作為組合優(yōu)化的項目，將pH固定在單因素優(yōu)化得到最佳值，即4.5。

均勻設計[10]是部分因子設計的主要方法之一，它是中國數理統(tǒng)計學家方開泰和數學家王元結合數論與多元統(tǒng)計理論而建立起來的一種實驗方法，它可以大大減少組合優(yōu)化中的實驗次數，提高效率；相比于正交設計，它尤其適用于因素少、水平多的實驗設計。

此處選用四因素九水平的均勻設計(U9*(94))，將番茄渣添加量40 g/L，豆粕添加量30 g/L，纖維素酶添加量8 g/L，酶解時間48 h作為9個水平中的中心水平，即第5水平；各因素的真實值變化步長分別為5、5、1、6。U9*(94)均勻設計表、各因素的真實值與水平值的對應關系以及相應的實驗結果如表1所示。

表1 均勻設計表與實驗結果

結果發(fā)現，當番茄渣添加量為50 g/L，豆粕添加量為10 g/L，纖維素酶添加量為12 g/L，酶解時間為54 h時，總類胡蘿卜素產量和增量分別為12.25 mg/L、10.25 mg/L，分別為本研究中所有的相應實驗結果中的最大值。

3 討論

為了尋求適用于類胡蘿卜素發(fā)酵生產的低成本原料，近10年來，人們做過多方面嘗試和努力。Buzzini等人在搖瓶規(guī)模上用葡萄汁、葡萄糖漿、甜菜糖漿、豆粉提取物、玉米粉提取物分別培養(yǎng)粘紅酵母、膠紅酵母、深紅酵母，對它們所產的類胡蘿卜素做了定量分析。最終發(fā)現，粘紅酵母用葡萄汁作為唯一碳源培養(yǎng)粘紅酵母，經過120 h的分批發(fā)酵后可獲得最大的總類胡蘿卜素產量為5.95 mg/L發(fā)酵液[11]。Tinoi等人用粉絲工廠的兩種常見廢棄物——綠豆粉、甘薯粉的硫酸水解產物分別作為粘紅酵母的氮源、碳源，并優(yōu)化了搖瓶培養(yǎng)過程的重要參數，發(fā)現在最優(yōu)條件下得到的總類胡蘿卜素濃度為(3.48±0.02) mg/L[9]。Aksu等人在2005年、2007年分別報道了膠紅酵母、粘紅酵母在搖瓶規(guī)模上發(fā)酵生產類胡蘿卜素的過程受pH值、溫度、初始碳源(葡萄糖、糖蜜蔗糖、乳清乳糖，3種不同碳源)濃度、初始硫酸銨濃度、表面活性劑(棉籽油和吐溫-80)濃度的影響。結果發(fā)現，吐溫-80對膠紅酵母的總類胡蘿卜素產量沒有促進作用，棉籽油只有在葡萄糖作為碳源且濃度較低的情況下才對產量有輕微的促進作用。實驗過程中膠紅酵母的最高的類胡蘿卜素產量為89.0 mg/L[12]。粘紅酵母受表面活性劑和棉籽油的影響與膠紅酵母非常相似。實驗可獲得的膠紅酵母的總類胡蘿卜素最大產量為125 mg/L[13]。 Valduga等人在搖瓶水平上采用完全二階設計優(yōu)化擲孢酵母利用工業(yè)廢棄物甘蔗糖蜜、玉米漿、酵母膏(預先用硫酸水解)為營養(yǎng)源，生產類胡蘿卜素的產量。發(fā)現在最優(yōu)條件下可獲取總類胡蘿卜素最大產量541.5 μg/L[14]。Malisorn等人在2008年、2009年分別考查了粘紅酵母利用蘿卜泡菜工廠的廢棄鹵水作為唯一營養(yǎng)源進行分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵生產β-胡蘿卜素的特性，并做了相應的優(yōu)化。發(fā)現在分批發(fā)酵下所獲得的最大β-胡蘿卜素產量為201 μg/L[15]；在連續(xù)發(fā)酵下所獲得的最大β-胡蘿卜素產量為186 μg/L[16]。Saenge等人用含有50%甘油的生物柴油工廠廢水作為粘紅酵母的唯一碳源，采用響應面法分析各個主要因素對胞內油脂和類胡蘿卜素含量的影響，發(fā)現碳氮比和甘油濃度有較大影響。實驗過程中獲得的最高脂質產量和最高總類胡蘿卜素產量分別為6.05 g/L和135.25 mg/L[17]。Marova等人考查了酵母膏、乳清、馬鈴薯浸膏、無機鹽、過氧化物等物質對多種紅酵母的生長和β-胡蘿卜素產量的影響。最終發(fā)現，粘紅酵母在乳清培養(yǎng)基中可獲得46 mg/L β-胡蘿卜素；膠紅酵母在含有馬鈴薯浸膏和5%無機鹽的培養(yǎng)基中可獲得56 mg/L β-胡蘿卜素[18]。

在本研究中，經過一系列的優(yōu)化，膠紅酵母利用番茄渣和豆粕的酶解產物發(fā)酵得到的總類胡蘿卜素產量以及扣除了番茄渣中總類胡蘿卜素之后計算得到的總類胡蘿卜素增量分別達到了12.25 mg/L和10.25 mg/L，相比于前人利用廢棄資源培養(yǎng)紅酵母屬菌種生產類胡蘿卜素的產量，這個結果比較理想，并且有希望在發(fā)酵罐規(guī)模上借助于溶氧條件的改善而進一步提高總類胡蘿卜素產量。本研究為膠紅酵母利用番茄渣和豆粕的酶解產物生產富含類胡蘿卜素的單細胞蛋白的可行性奠定了基礎，并且為微生物利用農產品廢棄物的水解液發(fā)酵生產高附加值食品添加劑的路線選擇提供了參考。

參考文獻：

[1]王偉杰，徐昌杰. 天然類胡蘿卜素生物合成與生物技術應用[J]. 細胞生物學雜志， 2006， 28: 839-843.

[2]Rock C L. Carotenoids: biology and treatment[J]. Pharmacol Therapeut， 1997， 75:185-197.

[3]Cheon L P， Claudia S D. Metabolic engineering towards biotechnological production of carotenoids in microorganisms[J]. Appl Biochem Biotech， 2002， 60:1-11.

[4]Avelino A， Avelino H T， Roseiro J C， et al. Saccharification of tomato pomace for the production of biomass[J]. Bioresource Technol， 1997， 61:159-162.

[5]Haddadin M S Y， Abu-Reesh I M， Haddadin F A S， et al. Utilisation of tomato pomace as a substrate for the production of vitamin B12-a preliminary appraisal[J]. Bioresource Technol， 2001， 78:225-230.

[6]Hidalgo A， Pompei C， Galli A. Uracil evolution in tomato pulp inoculated with different microbial strains during a long incubation time[J]. Food Chem， 2007， 104:1327-1332.

[7]Freixo M R， Karmali A， Frazǎo C， et al. Production of laccase and xylanase fromCoriolusversicolorgrown on tomato pomace and their chromatographic behaviour on immobilized metal chelates[J]. Process Biochem， 2008， 43:1265-1274.

[8]Chandi G K， Singh S P. Optimization of carotenoids byRhodotorulaglutinis[J]. Food Sci Biotechnol， 2010， 19(4): 881-887.

[9]Tinoi J， Rakariyatham N， Deming R L. Simplex optimization of carotenoid production byRhodotorulaglutinisusing hydrolyzed mung bean waste flour as substrate[J]. Process Biochem， 2005， 40:2551-2557.

[10]方開泰， 馬長興. 正交與均勻實驗設計[M]. 北京：科學出版社， 2001.

[11]Buzzini P， Martini A. Production of carotenoids by strains ofRhodotorulaglutiniscultured in raw materials of agro-industrial origin[J]. Bioresource Technol， 1999， 71:41-44.

[12]Aksu Z， Eren A T. Carotenoids production by the yeastRhodotorulamucilaginosa: use of agricultural wastes as a carbon source[J]. Process Biochem， 2005， 40:2985-2991.

[13]Aksu Z， Eren A T . Production of carotenoids by the isolated yeast ofRhodotorulaglutinis[J]. Biochem Eng J， 2007， 35:107-113.

[14]Valduga E, Valério A， Treichel H， et al. Study of the bio-production of carotenoids bySporidiobolussalmonicolor(CBS 2636) using pre-treated agro-industrial substrates[J]. J Chem Technol Biotechnol， 2008， 83:1267-1274.

[15]Malisorn C， Suntornsuk W. Optimization of b-carotene production byRhodotorulaglutinisDM28 in fermented radish brine[J]. Bioresource Technol， 2008， 99:2281-2287.

[16]Malisorn C， Suntornsuk W. Improved β-carotene production ofRhodotorulaglutinisin fermented radish brine by continuous cultivation[J]. Biochem Eng J， 2009， 43:27-32.

[17]Saenge C， Cheirsilp B， Suksaroge T T， et al. Potential use of oleaginous red yeastRhodotorulaglutinisfor the bioconversion of crude glycerol from biodiesel plant to lipids and carotenoids[J]. Process Biochem， 2011， 46:210-218.

[18]Marova I， Carnecka M， Halienova A， et al. Use of several waste substrates for carotenoid-rich yeast biomass production[J]. J Environ Manage， 2012， 95:S338-S342.