王從陽

(華僑大學生物醫(yī)學學院， 福建 泉州 362021)

丙型肝炎(Hepatitis C infection)是一種感染性疾病，嚴重危害著人類的健康，并且其流行趨勢呈世界性分布。跟據(jù)WHO統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，在全球范圍內(nèi)大約有1.7億丙型肝炎病毒(Hepatitis C infection，HCV)感染者[1-2]。在中國，大約有3800萬HCV感染者，其感染率約為3.2%，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例[3]。

研究表明[4-5]，丙型肝炎的治療方式與治療效果與病毒基因型密切相關(guān)，基因型1和基因型4的患者使用聚乙二醇干擾素、利巴韋林(PegIFN/RBV)聯(lián)合治療48周；基因型2和基因型3的患者使用聚乙二醇干擾素、利巴韋林(PegIFN/RBV)聯(lián)合治療24周。另有研究表明[2]，除了病毒方面的因素(基因型、HCV RNA水平)外，患者自身的因素也能對抗病毒治療效果進行預測，其中IL28B多態(tài)性是一個重要的預測因子[6-7]。

IL28B基因位于第19號染色體短臂(19q13)，編碼干擾素λ(IFN-λ-3)參與抗病毒免疫反應，IL28B能刺激干擾素釋放，增加細胞毒性T淋巴細胞的數(shù)量。可以由病毒感染等誘導產(chǎn)生并且在人上皮細胞等細胞中產(chǎn)生[7]。IL28B基因有多種SNPs，像SNP rs12979860，SNP rs8099917，SNP rs12980275，還有最新發(fā)現(xiàn)的SNP rs469415590[8]。而通過全基因組相關(guān)性研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)，位于其附近的SNP rs12980275多態(tài)性與聚乙二醇干擾素、利巴韋林聯(lián)合治療的效果具有顯著相關(guān)性[9]。目前研究者將不同的IL28B相關(guān)的SNP基因型稱為保護性和非保護性基因型[10]，保護性SNP基因型攜帶者治療后獲得SVR的幾率高于非保護性基因攜帶者，對于rs12980275來說，A/A為保護性，G/A或者G/G為非保護性基因型，其中，A/A與1型HCV RVR[11]和SVR[12]密切相關(guān)，但對2或3型HCV患者并沒有預測價值。在漢族人群中， HCV的自發(fā)清除與SNP rs12980275 A/A基因型也有很大關(guān)系[13]。同時，SNP rs12980275 的A/A基因型對HBeAg陽性的慢性乙肝患者來說也是保護基因型[14]。

IL28B基因多態(tài)性是目前為止GWAS發(fā)現(xiàn)用于個性化臨床治療的最好典范之一[2, 9, 15-16]。因此，為了獲取可靠的檢測結(jié)果，構(gòu)建IL28b基因rs12980275位點的質(zhì)粒標準品非常必要。

1 材料與方法

1.1 材料

外周血樣本16份。按照IL28B基因組DNA序列，利用Primer Primier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計、評價引物，目的片段大小為334 bp，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：F為5′-GGTGTTTGCTACATTGTTCGGCA-3′，R為5′-TTGGGCAACAAGAGCGAAACT-3′。 pGM-T載體、大腸埃希菌DH5α；瓊脂糖凝膠DNA片段回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。外周血DNA提取試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與擴增

外周血DNA的提取采用Wizard?基因組DNA純化試劑盒。DNA提取后，用F和R引物進行PCR反應，反應體系為：mix 25 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 21 μL，總體積50 μL。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。然后進行瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆

PCR產(chǎn)物的回收：在紫外燈下將PCR產(chǎn)物回收，切出含有目的DNA片段(334 bp)的瓊脂糖凝膠，操作過程中要求盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，然后按瓊脂糖凝膠DNA片段回收純化試劑盒說明進行回收。

PCR產(chǎn)物的克?。?T載體在冰上融化，連接反應液為pGM-T Vector 1 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、PCR產(chǎn)物4 μL，總體積10 μL，于16℃連接過夜，目的基因IL28B rs12980275片段克隆至pGM-T Vector上，然后進行轉(zhuǎn)化實驗，至大腸埃希菌DH5α中，在含有氨芐的LB培養(yǎng)基上涂布，37℃下倒置培養(yǎng)12～16 h，形成單菌落。挑選白色菌落，用菌落PCR鑒定。并按質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒DNA。用紫外分光光度計測定質(zhì)粒純度及濃度，質(zhì)粒DNA的OD260/OD280為1.6～1.8。送上海生工生物工程有限公司測序，采用Blast分析結(jié)果。

1.2.3 重組質(zhì)粒標準品的制備

將重組質(zhì)粒標準品原液稀釋成0.01～10 ng/μL 4個梯度的標準品，然后進行PCR擴增并送上海生工生物工程有限公司測序。量取同體積同濃度的野生純合質(zhì)粒和突變純合質(zhì)?；靹?，進行PCR擴增后并送上海生工生物工程有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列下載及突變位點確定

IL28B基因位于19號染色體，SNP rs12980275則位于IL28B基因下游2.4 kb處，該位點堿基野生型為A，突變型為G。

2.2 引物驗證

將設(shè)計好的引物進行Blast比對，特異性良好。以16個gDNA樣本為模板，通過PCR擴增，獲得IL28B基因rs12980275片段的序列、大小約334 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果與期望值一致，如圖1。目的條帶清晰單一，說明所設(shè)計引物適用。

M—DL500 DNA Marker； 1-16—樣本序列號； “-”—空白對照(檢測到條帶位于marker條帶的300 bp和400 bp之間)。

圖1引物驗證電泳圖

Fig 1 Primers tested by electrophoresis

2.3 標準品制備的DNA樣本篩選

將擴增成功的16管PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務有限公司測序。對各個序列進行比較，選出IL28B rs12980275位點為堿基AA和GG的樣本作為標準品制備DNA樣本。

從16個樣本的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA型樣本有12個，AG型樣本3個，GG型樣本1個(見圖2)。

(箭頭指示位置為SNP rs12980275位點)

2.4 連接轉(zhuǎn)化結(jié)果

利用天根pGM-T克隆試劑盒，連接轉(zhuǎn)化IL28B rs12980275位點為堿基AA和GG的對應PCR產(chǎn)物片段，得到相應的轉(zhuǎn)化平板(如圖3)。

(白色菌落為轉(zhuǎn)化成功菌落)

圖4 菌落PCR電泳圖

1-3—AA型菌落； 4-6—GG型菌落； “-”—空白對照； M—DL500 DNA Marker(檢測到條帶位于marker條帶的300 bp和400 bp之間)。

用滅菌的牙簽挑取白色菌斑，以引物F和R進行菌落PCR實驗，AA和GG兩種基因型的轉(zhuǎn)化平板上各挑取3個菌落，并做好對應標記。菌落PCR電泳結(jié)果如圖4，片段長度334 bp左右，證實片段連接正確。

2.5 質(zhì)粒標準品構(gòu)建結(jié)果

將經(jīng)菌落PCR檢測為陽性的AA型菌落1和GG型菌落4接種到10 mL LB(含有100 μg/mL的氨芐青霉素)培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果(圖5)。

1—AA型質(zhì)粒; 2—GG型質(zhì)粒; M—DL500 DNA Marker

圖5質(zhì)粒提取電泳圖

Fig 5 Result of plasmid electrophoresis

將提取的質(zhì)粒送上海生工測序，結(jié)果如圖6和圖7，堿基序列正確。與GenBank進行BLAST比較，結(jié)果(圖8)表明：插入片段全長為334 bp，與GenBank號為AC011445.6的序列100%一致。

(箭頭指示位置為SNP rs12980275位點)

圖6 AA型質(zhì)粒標準品測序報告

Fig 6 Result of sequence detected by standard plasmid sample 6AA

(箭頭指示位置為SNP rs12980275位點)

圖7 GG型質(zhì)粒標準品測序報告

Fig 7 Result of sequence detected by standard plasmid sample 7GG

2.6 質(zhì)粒標準品稀釋試驗以及混合試驗結(jié)果

將質(zhì)粒標準品稀釋成0.01～10 ng/μL 4個梯度進行PCR擴增，結(jié)果如圖9，質(zhì)粒濃度0.01 ng/μL時，擴增條帶不明顯；質(zhì)粒濃度達0.1 ng/μL甚至更高時，可得到單一的清晰條帶。送樣測序結(jié)果也顯示，質(zhì)粒濃度達0.1 ng/μL時，才可成功獲取清晰的測序圖譜。0.1 ng/μL 的質(zhì)粒在-20℃凍存6個月試驗結(jié)果穩(wěn)定。

(紅色標記位置為SNP rs12980275位點)

圖8 AA型(左)和GG型(右)序列Blast比對結(jié)果

Fig 8 Comparison of type AA with type GG by Blast N

M—DL500 DNA Marker; “-”—空白對照; 1-4—0.01～10ng/μL(檢測到條帶位于marker條帶的300 bp和400 bp之間)。

圖9質(zhì)粒稀釋PCR電泳圖

Fig 9 Result of diluted PCR electrophoresis

量取同體積的0.1 ng/μL野生純合質(zhì)粒和突變純合質(zhì)粒，混勻，進行PCR擴增測序，成功得到rs12980275位點雜合突變的序列圖譜(圖10)。

(箭頭指示位置為SNP rs12980275位點)

圖10 AA型和GG型質(zhì)粒標準品1∶1混合的測序報告

Fig 10 Sequence detected by the mixture of standard plasmid samples of type AA and type GG with a ratio of 1∶1

3 討論

在本研究中，先將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，然后抽提質(zhì)粒，最后成功構(gòu)建了檢測IL28B rs12980275位點突變的標準品，該標準品具有純度高、易于保存、分型準確等優(yōu)點，可長期用于檢測。該標準品在-20℃條件下具有良好的穩(wěn)定性。經(jīng)過毛細管電泳測序，證明該標準品為IL28B基因上包含rs12980275位點序列的特異性產(chǎn)物。對不同濃度的質(zhì)粒模板進行擴增測序的實驗結(jié)果分析，質(zhì)粒濃度達0.1 ng/μL時，PCR擴增即可得到單一的清晰條帶，-20℃凍存6個月試驗結(jié)果穩(wěn)定。同體積的0.1 ng/μL野生純合質(zhì)粒和0.1 ng/μL突變純合質(zhì)?；靹?，PCR擴增送測序可得到清晰的rs12980275雜合突變序列圖譜。

鑒于IL-28b基因多態(tài)性可預測丙型肝炎患者抗病毒治療效果等的臨床價值[17]，各國已開始重視該基因的檢測[15]。本研究中IL28B rs12980275位點AA(野生型)、GG(純合突變)和AG(雜合突變)3種質(zhì)粒標準品的成功構(gòu)建，對以后該試劑盒研發(fā)工作的開展是一項有力保障。

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