金 蕾, 徐善良, 邱成功, 方增冰

(1. 寧波大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 浙江 寧波 315211； 2. 寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)簡稱“梭子蟹”，北方俗稱“籃蟹”、“螃蟹”，南方稱“白蟹”、“膏蟹”，浙南稱“江蟹”，是一種大型海洋經(jīng)濟(jì)食用蟹類。三疣梭子蟹肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，風(fēng)味獨特，深受國內(nèi)外消費者喜愛，又是重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品[1]。研究表明，三疣梭子蟹不僅蛋白質(zhì)含量高，且氨基酸種類齊全、組成理想，人體所必需的氨基酸含量較高[2]，礦物元素豐富，還含有多種對人體新陳代謝所必需的脂肪酸及維生素，其營養(yǎng)價值勝過一般的肉類食品[3]。

迄今，有關(guān)三疣梭子蟹肌肉組織中營養(yǎng)組成及風(fēng)味成分已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，分別研究了其蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和無機(jī)元素的含量[4]，比較了野生與養(yǎng)殖蟹的氨基酸與脂肪酸組成[2]，分析了三疣梭子蟹肌肉中的風(fēng)味化合物[5]，還研究了胚胎和幼體發(fā)育過程中的生化成分和氨基酸變化[6-7]等。海產(chǎn)品組織中的甜菜堿、糖原及無機(jī)鹽作為呈味物質(zhì)的重要成分，起到輔助呈味作用，可以滿足人們口感品質(zhì)的要求[3]。三疣梭子蟹蟹肉的口感、風(fēng)味因生長環(huán)境、營養(yǎng)條件、雌雄性別和發(fā)育階段的不同，存在著顯著的差異[2]，因此，研究比較三疣梭子蟹不同生長階段及雌雄蟹肌肉組織中的甜菜堿、糖原及無機(jī)鹽含量，有助于分析不同蟹口感、風(fēng)味的特點和差異。

本論文對三疣梭子蟹不同階段肌肉組織中甜菜堿、糖原及無機(jī)鹽(K、Na、Ca、Mg、Fe)含量進(jìn)行了測定分析，以期為今后提高三疣梭子蟹品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實驗所用的三疣梭子蟹均采自浙江舟山市沈家門漁港的海捕野生個體，按3個不同的發(fā)育階段，在3個季節(jié)分別采集了幼蟹、交配前和交配后2種成蟹。具體采樣時間、規(guī)格及數(shù)量見表1。

表1 樣品的采集時間、規(guī)格及數(shù)量

所有實驗用蟹均活體解剖取肌肉組織。從頭胸甲與腹部連接處打開甲殼，細(xì)心剝離頭胸甲及附肢中的肌肉，將每尾蟹的肌肉組織分別稱重(精確至0.01 g)編號后，置-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

雷氏鹽溶液，上海邁坤化工有限公司；蒽酮試劑，上海隆壘生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721型分光光度計，上海光譜儀器有限公司; 高速離心機(jī)，北京時代北利離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甜菜堿含量的測定

原理：甜菜堿在pH值為1時能和雷氏鹽生成紅色沉淀，將沉淀過濾洗凈后溶于70%的丙酮中，呈粉紅色溶液，在525 nm處測定吸光度[8]。

用乙醇萃取法提取甜菜堿：精確稱取冷凍肌肉樣品1 g，加蒸餾水5 mL，內(nèi)切勻漿攪拌，沸水浴1 h震蕩攪拌，冷卻至室溫。加入95%乙醇20 mL，4℃冷藏過夜。次日，離心6000 r/min，20 min，分離，沉淀用80%乙醇10 mL洗滌沉淀離心2次，合并上清液，減壓濃縮，用蒸餾水定容25 mL。冰箱冷藏備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取1、2、3、4、5 mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于具塞試管中，依次加入4、3、2、1、0 mL蒸餾水，用冰浴冷卻15 min后，滴加雷氏鹽溶液5 mL，振搖，放回冰浴，保藏1 h。從冰浴中取出試管輕微搖動，使結(jié)晶懸浮。6000 r/min離心10 min，棄上清，用乙醚洗液洗滌結(jié)晶。然后，用丙酮溶液溶解甜菜堿雷氏鹽結(jié)晶，濾液收集于比色管中，用丙酮溶液定容，在721型分光光度計上，于525 nm處測定吸光度值。

甜菜堿的測定：移取試樣制備液5 mL，用冰浴冷卻15 min，再用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值至1，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。每個樣品做3次平行實驗，所測的吸光度取平均值，代入由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程中，算出甜菜堿的含量。

1.3.2 糖原含量的測定

原理：糖原在濃硫酸將加熱條件下水解為葡萄糖，而葡萄糖分子中醛基在濃硫酸中能與蒽酮發(fā)生特異性反應(yīng)，形成混合物其最大吸收波長為620 nm，顏色深淺與葡萄糖濃度呈正比[9]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取7支干燥潔凈的試管，編號后，每管加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和水后立即混勻，迅速置于冰浴中，加入蒽酮試劑后，同時置于沸水浴中，準(zhǔn)確加熱15 min，立即取出置冰浴中迅速冷卻。待冷卻到室溫后，第一管為空白，迅速測其余各管的光吸收值。

樣品的預(yù)處理：精確稱取冷卻肌肉樣品(200 mg)放入離心管內(nèi)，加入5%的三氯醋酸4 mL，勻漿1 min后3000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，重復(fù)操作1次，將2次上清液合并。用振蕩器充分混勻。取上清液1 mL放入10 mL離心管中，加入95%乙醇4 mL，充分混勻至2種液體間沒有分界面；室溫下靜置過夜。然后3000 r/min、4 ℃條件下離心1 min，棄去上清液后，試管倒置10 min空干。

每個樣品做3次平行實驗，所測的吸光度取平均值，代入由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程中，算出糖原的含量。

1.3.3 無機(jī)鹽含量的測定

樣品經(jīng)消化后，導(dǎo)入原子吸收分光光度計中，經(jīng)火焰原子化后，在吸收波長的共振線下，其吸收量與K、Na、Ca、Mg和Fe的含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較就可確定K、Na、Ca、Mg和Fe的含量。

本部分實驗無機(jī)鹽含量的測定主要是采用原子吸收分光光度法，樣品經(jīng)混合酸消化液消化后，測定其中K、Na、Ca、Mg和Fe的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個發(fā)育階段的甜菜堿含量比較

通過甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到3個發(fā)育階段各樣品的甜菜堿含量見圖1。由圖1可見，8月份幼蟹的甜菜堿含量最低，為172 mg/100 g，10月份交配前的雌蟹中甜菜堿的含量最高，達(dá)473 mg/100 g,顯著高于幼蟹和交配蟹，且是未交配雄蟹的2倍多。而在12月份交配后雌、雄蟹的甜菜堿含量相近。隨著蟹的生長，雌、雄蟹在不同發(fā)育階段肌肉中的甜菜堿含量表現(xiàn)不同，雌性蟹甜菜堿表現(xiàn)為從幼蟹時的低水平迅速上升至未交配時的峰值，但交配后減半。雄性蟹則表現(xiàn)為隨著發(fā)育肌肉中的甜菜堿逐漸升高。

圖1 不同發(fā)育階段雌雄蟹肌肉中甜菜堿的含量變化

KNaCaMgFe幼蟹336.94±8.73185.59±2.8622.66±0.1524.71±0.211.21±0.03交配前雌蟹416.26±9.54131.92±4.2317.35±0.3223.69±0.131.26±0.02交配后雌蟹457.63±11.43174.31±3.4522.48±0.2422.75±0.451.12±0.02

2.2 3個發(fā)育階段的糖原含量比較

用獲得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到3個發(fā)育階段各個樣品肌肉組織中糖原含量見圖2。

圖2 不同發(fā)育階段雌雄蟹肌肉中糖原的含量

圖2中顯示，3個發(fā)育階段的蟹肌肉中糖原含量差異顯著，幼蟹階段的糖原含量極低，僅為0.8 μg/mg，至交配前的成蟹階段，雌蟹肌肉中的糖原含量升高一倍，雄蟹則繼續(xù)保持較低水平；交配后，雌雄蟹肌肉中的糖原含量急劇升高，雌蟹上升至11.26 μg/mg，是交配前的6.5倍，雄蟹達(dá)到9.61 μg/mg，是交配前的10倍。由此可見，隨著三疣梭子蟹的發(fā)育，其肌肉中的糖原含量呈上升趨勢。

2.3 不同發(fā)育階段三疣梭子蟹肌肉中無機(jī)鹽含量的變化

實驗測定了雌蟹在3個發(fā)育階段的肌肉中k、Na、Ca、Mg和Fe的含量，見表2。從表2中可以看出，肌肉中5種無機(jī)鹽含量依次為K>Na>Mg >Ca>Fe。比較發(fā)現(xiàn)，在三疣梭子蟹肌肉中k的含量隨著發(fā)育階段呈緩慢上升趨勢；Na和Ca的含量則以交配前階段最低；Mg的含量隨發(fā)育階段有所下降； Fe的含量表現(xiàn)為交配后最低。

3 討論

3.1 甜菜堿、糖原及無機(jī)鹽在海產(chǎn)品呈味中的重要作用

糖原是動物體內(nèi)糖的貯存形式，有“動物淀粉”之稱。糖原是動物肌肉組織中重要的營養(yǎng)成分之一，在動物肉類中除了能起到主要的供能作用外，還起到了輔助的呈味作用，其含量與肉品品質(zhì)密切相關(guān)[10]。

無機(jī)鹽是人類不可缺少的營養(yǎng)要素,無機(jī)鹽與健康的關(guān)系一直是人們長期探討和關(guān)注的問題之一[14]。無機(jī)鹽也是動植物生命活動所必需的。在海產(chǎn)品中，無機(jī)鹽作為呈味成分之一，為海產(chǎn)品提供了口感品質(zhì)的保證。Ca在蟹類中有重要的作用，是甲殼的主要構(gòu)成成分?？梢跃S持蟹類生長發(fā)育、健康以及繁殖。而Mg是維持骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能所必需的元素，是膽堿酯酶等的活化因子，具有使ATP轉(zhuǎn)化成ADP及抑制神經(jīng)興奮等作用[15]。Na的生理功能主要是共同維持體液的滲透壓和調(diào)節(jié)酸堿平衡，并能與其它離子一起參與維持正常肌肉神經(jīng)的興奮性及參與神經(jīng)沖動的傳遞。K的大部分生理功能都是在與Na協(xié)同作用中發(fā)揮的，因此維持體內(nèi)K離子和Na離子的平衡，對生命活動中滲透壓的調(diào)節(jié)有重要意義。Fe在動物體內(nèi)主要參與載體的組成、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存營養(yǎng)素，還能參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝。因此，研究三疣梭子蟹肌肉組織中無機(jī)鹽的意義非常重要。

3.2 三疣梭子蟹肌肉中甜菜堿含量隨發(fā)育階段的變化

在幼蟹階段由于雌雄性別剛剛分化，甜菜堿含量不及成體。雌蟹肌肉中的甜菜堿含量交配前大于交配后，雄蟹則交配前含量略低于交配后。資料顯示，三疣梭子蟹的雌蟹在交配后，其卵巢發(fā)育期儲備的各種能量和營養(yǎng)往往消耗很大[16]。甜菜堿參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，甜菜堿在體內(nèi)代替蛋氨酸作為甲基供體，而參與甲基的循環(huán)和代謝[1]。交配前肌肉中的甜菜堿儲備量豐富，隨著交配行為的發(fā)生，雌蟹的卵巢開始發(fā)育，將肝胰腺、肌肉中的營養(yǎng)向卵巢大量轉(zhuǎn)移，這可能導(dǎo)致了肌肉中甜菜堿被不斷消耗和轉(zhuǎn)移，從而出現(xiàn)了逐步降低的現(xiàn)象。然而，雄蟹的生殖生理與雌蟹截然不同，只是在交配期會消耗大量的能量物質(zhì)，交配后大部分雄蟹便會死去，幸存下來的雄蟹都是一些體質(zhì)強(qiáng)壯的個體，肌肉中的甜菜堿逐漸得到補(bǔ)充而略有升高。

甜菜堿也存在于鮑魚(Abalone)、魷魚(Architeuthis dux)、牡蠣(Ostrea gigas thunberg)和貽貝(Mytilus edulis)等眾多貝類中。有研究表明，在三疣梭子蟹、蝦頭、蝦米、干貝、干貽貝、凍貽貝和雜色蛤仔這7種海產(chǎn)品中，呈味成分甜菜堿的含量,以三疣梭子蟹中含量最高[11]；海養(yǎng)和淡養(yǎng)的凡納濱對蝦中甜菜堿含量分別為268 mg/100 g和179 mg/100 g[12]，而本實驗測得野生三疣梭子蟹肌肉中甜菜堿含量最高為473 mg/100 g。由此可見，三疣梭子蟹肌肉中的甜菜堿含量遠(yuǎn)高于一般水產(chǎn)品，所以三疣梭子蟹的蟹肉入口爽滑帶有甜味，口感品質(zhì)極佳。

3.3 交配前后雌雄蟹肌肉中糖原含量的差異與口感品質(zhì)的關(guān)系

糖原是動物體內(nèi)葡萄糖的儲存形式，分為肝糖原和肌糖原2種[17]。肝糖原可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖，以維持血糖的濃度。但肌糖原不能直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖，它的分解產(chǎn)物為乳酸，乳酸可以通過血液循環(huán)在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變成肝糖原或葡萄糖而被機(jī)體利用。

研究表明，甲殼動物營養(yǎng)物質(zhì)的積累除了可以渡過食物缺乏的冬季外，還與生殖產(chǎn)物的形成密切相關(guān)。事實上雄性性腺的發(fā)育還需消耗糖類物質(zhì)，在性腺快速發(fā)育前期，雄蟹精巢和副性腺中葡萄糖及糖原含量明顯高于其他時期[18]。由此可見，在交配前，雄蟹肌肉中糖原的積累與其性腺的發(fā)育有關(guān)。雄蟹肌肉中所積累的糖原，在交配前大部分供精巢所需，故肌肉組織中含量極低，生殖活動結(jié)束后，雄蟹肌肉中的糖原才開始快速積累。但雌蟹性腺發(fā)育所需的能量極少來自糖類物質(zhì)[19]，因此，交配后葡萄糖在體內(nèi)就以糖原的形式貯存在肌肉中，逐漸達(dá)到11.26 μg/mg的水平。

有研究表明，糖類對呈味的作用不是很明顯，但起著一定的協(xié)同作用[12]。蝦蟹等海產(chǎn)品的香味屬于加熱反應(yīng)的香氣，糖原是香味前體物質(zhì)之一, 它在加熱過程中能產(chǎn)生二酮醛、醇、吠喃類化合物，可以增加蟹肉風(fēng)味的淳厚感以及鮮美程度[20]。這也印證了本研究的結(jié)果，三疣梭子蟹交配后隨著肌肉中糖原含量不斷增加，其風(fēng)味也更佳，鮮美程度更高，促進(jìn)了蟹肉的品質(zhì)的不斷提高。

3.4 發(fā)育階段與三疣梭子蟹肌肉中無機(jī)鹽含量的關(guān)系

有研究表明，海產(chǎn)品中鉀、鈉、鈣、鎂等宏量元素含量十分豐富，并且同一元素在不同的海產(chǎn)品中含量變化很大。其中鈣的變化范圍最大是5～991 mg/100 g，海產(chǎn)品對鉀、鈉有很好的富集作用,其含量都比較高，海產(chǎn)品中微量元素鐵的變化范圍是0.20～22.60 mg/100 g[21]。本實驗所得結(jié)果符合上述結(jié)論，比較K、Na、Ca、Mg、Fe這5種無機(jī)鹽，同樣發(fā)現(xiàn)在三疣梭子蟹肌肉中K、Na的含量比較高，F(xiàn)e的含量最低。無機(jī)鹽的多少也會直接影響三疣梭子蟹的口感。三疣梭子蟹是藍(lán)血動物，體內(nèi)Cu作為血蛋白成份，故測得Fe的含量很低。同樣是甲殼動物的日本對蝦并不需要鐵, 金澤夫等[22]認(rèn)為餌料中鐵的含量會抑制對蝦的生長。這和本實驗得到的鐵含量最低結(jié)果相一致。

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