周占清, 趙群芬, 陳曉菲, 劉 林

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211 )

納米材料因其特殊的顆粒尺寸及特有的物理化學(xué)性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用。隨著大量的生產(chǎn)和應(yīng)用，納米顆粒將不可避免地向環(huán)境中釋放，最終會(huì)進(jìn)入水環(huán)境，由此很可能給水生生物帶來潛在的威脅。因此納米材料對(duì)水生生物的生物效應(yīng)越來越受到人們的關(guān)注[1-7]。納米ZnO是一種新型高功能精細(xì)無機(jī)產(chǎn)品，主要應(yīng)用于紡織工業(yè)、抗菌玻璃、橡膠工業(yè)、建筑材料涂料工業(yè)和光催化劑等領(lǐng)域。最初認(rèn)為納米ZnO是無毒的，對(duì)生物是安全的，但是隨著報(bào)道其對(duì)藻類有毒性以來[8]，陸續(xù)又有報(bào)道稱納米ZnO對(duì)人肺上皮細(xì)胞[9]、革蘭氏陽性菌有毒性[10]，對(duì)小鼠肝組織DNA有損傷[11]。并發(fā)現(xiàn)納米ZnO的毒性機(jī)制可能是參與活性氧化物的形成及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

金屬氧化物可能通過光照、干擾細(xì)胞代謝及細(xì)胞間相互作用生成ROS，而過量的ROS可能會(huì)破壞抗氧化酶系統(tǒng)，從而對(duì)GSH、MDA和Na+K+-ATPase造成影響，出現(xiàn)組織器官蛋白、DNA和膜損傷[8]。ZnO納米顆粒是金屬氧化物的一種，隨著ZnO納米顆粒廣泛地應(yīng)用，通過生活和工程應(yīng)用等途徑進(jìn)入水環(huán)境，對(duì)水生生物可能會(huì)產(chǎn)生一定的毒性作用。本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究了ZnO納米顆粒處理下肝組織解剖結(jié)構(gòu)以及ROS、GSH、MDA含量、Na+K+-ATPase活性的變化，以探討納米顆粒的毒性效應(yīng)及引起該效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚(Daniorerio)購于寧波天勝花鳥市場(chǎng)，平均體長3.00 cm±0.30 cm，平均體重0.50 g±0.05 g，實(shí)驗(yàn)前至少馴養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖水為去氯充分曝氧的自來水，水溫24℃±0.5℃，每日喂食1次，馴養(yǎng)期間無死亡。實(shí)驗(yàn)前1 d停止投餌，實(shí)驗(yàn)期間不間斷充氧。

納米ZnO(25nm±2nm)：購于杭州大洋納米新材料有限公司。還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Na+K+-ATPase、活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒購于南京建成生物研究所。

1.2 方法

處理組斑馬魚的納米ZnO濃度分別為2.8 mg/L、5.6 mg/L、11.2 mg/L、22.4 mg/L和44.8 mg/L，暴露試驗(yàn)參照GB/T13276-1991，約1 L的水中暴露1 g斑馬魚，每容器7～8尾魚， 3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即解剖取出肝組織，加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.01 mol/L Tris-HCl、0.001 mol/LEDTA-2Na、0.01 mol/L蔗糖，pH值7.4)研磨，2000～4000 r/min離心，取上清，參照試劑盒說明，分別測(cè)定GSH、MDA、Na+K+-ATPase和ROS。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

GSH以每克組織蛋白中GSH的mg數(shù)表示，MDA以每毫克組織蛋白中MDA的nmol數(shù)表示，Na+K+-ATPase活力定義為：每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷量為一個(gè)ATP酶活力單位(μ)。ROS以熒光強(qiáng)度/毫克蛋白表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One Way ANOVA)，差異顯著性檢驗(yàn)采用Turkey法，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織GSH影響

不同濃度ZnO納米顆粒處理下，斑馬魚肝組織中GSH活性變化見圖1，各處理組中斑馬魚肝組織中GSH含量顯著少于對(duì)照組(P<0.05)，說明ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織的GSH含量有明顯的抑制作用。

圖1 不同濃度ZnO納米顆粒在不同時(shí)間對(duì)斑馬魚肝組織GSH影響(“*”表示P<0.05)Fig 1 The effect of GSH on Danio rerio liver tissue at different nano-ZnO expose concentrations and treatment time (“*”means p<0.05)

2.2 ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織MDA影響

從圖2看出，ZnO納米顆粒懸浮液對(duì)斑馬魚肝組織有明顯的脂質(zhì)過氧化損傷。在ZnO納米顆粒暴露不同的時(shí)間后，各濃度處理組的斑馬魚肝組織MDA含量隨著ZnO納米顆粒濃度的升高而升高，與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)

圖2 不同濃度ZnO納米顆粒在不同時(shí)間對(duì)斑馬魚肝組織MDA影響(“*”表示P<0.05)Fig 2 The effect of MDA on Danio rerio liver tissue at different nano-ZnOexpose concentrations and treatment time (“*”means P<0.05)

2.3 ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織Na+K+-ATPase影響

圖3不同濃度ZnO納米顆粒在不同時(shí)間對(duì)斑馬魚肝組織Na+K+-ATPase影響(“*”表示P<0.05)Fig 3 The effect of Na+K+-ATPase on Danio rerio liver tissue at different nano-ZnO expose concentrations and treatment time (“*”means P<0.05)

ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織Na+K+-ATPase的活性影響與處理的時(shí)間和濃度有關(guān)(圖3)。在6 h和12 h，ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織Na+K+-ATPase起到誘導(dǎo)作用；而處理24 h后，ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織Na+K+-ATPase具有顯著的抑制作用(p<0.05)。

2.4 ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織ROS影響

如圖4中所示，24 h暴露不同濃度的ZnO納米顆粒后，肝組織細(xì)胞中ROS含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別為對(duì)照組的111.54%、133.23%、165.41%、177.48%和131.94%。ZnO納米顆粒在肝組織細(xì)胞中產(chǎn)生過量的ROS，造成過氧化損傷。

圖4 不同濃度ZnO納米顆粒處理24 h后對(duì)斑馬魚肝組織ROS影響(“*”表示P<0.05)Fig 4 The effect of ROS on Danio rerio liver tissue at different nano-ZnO expose concentrations and treatment time (“*”means P<0.05, “**” means P<0.01)

3 討論

外源物質(zhì)通過攝食、表面接觸等途徑進(jìn)入魚體后會(huì)引起魚的一系列生理生化反應(yīng)，而肝組織是其中比較敏感的組織器官，它將有毒物質(zhì)代謝反應(yīng)后變成低毒或無毒的代謝物，最終排出體外。但有毒物質(zhì)濃度過高會(huì)造成肝細(xì)胞損傷，使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)表現(xiàn)異常和病變，肝組織的生理代謝活動(dòng)也會(huì)受到影響，表現(xiàn)為生理指標(biāo)的變化，所以，魚類的肝組織中的形態(tài)和生理的變化可以作為環(huán)境中有毒物質(zhì)污染的生物指示[13]。

GSH能清除體內(nèi)氧自由基(H2O2)，輕度的外界刺激能誘導(dǎo)GSH[14]，過量刺激(如ROS)則會(huì)導(dǎo)致其耗竭[15]。本研究中，與對(duì)照組相比，處理組中斑馬魚肝組織中GSH含量均減少，這很可能是斑馬魚的肝受到了納米氧化鋅的嚴(yán)重刺激，產(chǎn)生了過量的ROS，而ROS的產(chǎn)生耗竭了GSH，這與Ahmad等研究硅納米顆粒處理后人肝細(xì)胞株HepG2，ROS升高，GSH減少的結(jié)果相似[16]。

MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化物在氧自由基的作用下形成的一種脂質(zhì)過氧化物，MDA作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，其含量變化反映了機(jī)體損傷程度。Govindasamy等發(fā)現(xiàn)，納米銀處理羅非魚肝臟中MDA含量增加，并且抑制了抗氧化酶活性，隨之破壞了魚體內(nèi)氧化酶和抗氧化酶之間的平衡[17]。Wu等報(bào)道納米TiO2對(duì)小鼠體內(nèi)和體外潛在的生物毒性，小鼠皮膚和肝臟MDA含量有顯著升高，說明納米顆粒的沉積間接誘導(dǎo)了病理損傷[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組中斑馬魚肝組織中MDA的含量是增加的，說明納米氧化鋅顆粒在斑馬魚體內(nèi)沉積，并隨著體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，破壞肝臟中的氧化酶和抗氧化酶系統(tǒng)，從而對(duì)肝臟造成氧化損傷。

有研究報(bào)道，當(dāng)魚受到環(huán)境中污染物的脅迫時(shí)，Na+K+-ATPas活性會(huì)被抑制，或先升高再降低[19-21]，故現(xiàn)認(rèn)為Na+K+-ATPase是一種很有潛力的環(huán)境污染效應(yīng)的生物標(biāo)志物，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)24 h前Na+K+-ATPase活性隨著納米顆粒濃度的升高而升高，24 h后隨著ZnO納米顆粒濃度的升高，Na+K+-ATPase活性逐漸降低，說明ZnO納米顆粒在初期刺激斑馬魚肝中的Na+K+-ATPase的活性，是魚對(duì)環(huán)境中異物的一種應(yīng)急防御反應(yīng)，隨后隨著脅迫時(shí)間和ZnO納米顆粒濃度的增加，超過防御機(jī)制的承受能力故而表現(xiàn)為Na+K+-ATPase的活性降低。

ROS容易侵襲多不飽和脂肪酸，損害細(xì)胞功能,有報(bào)道顯示高濃度的納米TiO2使小鼠大腦產(chǎn)生明顯的ROS，產(chǎn)生的過量ROS會(huì)破壞大腦中氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[22]。通常，當(dāng)ROS升高或ROS防御體系破壞，細(xì)胞或動(dòng)物就可稱為產(chǎn)生了氧化應(yīng)激[23-25]。本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到ZnO納米顆粒處理組ROS水平顯著高于對(duì)照組，說明ZnO納米顆粒刺激斑馬魚產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。

ROS, MDA和GSH是3種重要的氧化應(yīng)激生理生化指示劑。通常情況下，組織細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)保護(hù)其不受ROS的攻擊，消除或者減弱氧化損傷。而相反的，當(dāng)ROS和MDA水平升高以及GSH水平降低時(shí)，組織細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并最終導(dǎo)致?lián)p傷。本實(shí)驗(yàn)中ZnO納米顆粒刺激魚體內(nèi)產(chǎn)生ROS的機(jī)制可能為干擾細(xì)胞代謝活動(dòng)產(chǎn)生ROS或干擾細(xì)胞間相互作用促進(jìn)產(chǎn)生ROS。所有的處理組都顯示了ZnO納米顆粒對(duì)斑馬魚肝組織產(chǎn)生了明顯的毒理作用，表明雖然納米顆粒在水中可能產(chǎn)生團(tuán)聚作用，但其仍對(duì)組織器官產(chǎn)生毒性影響。一方面，組織細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可能是由于氧化鋅納米顆粒進(jìn)入肝臟細(xì)胞中，對(duì)線粒體造成損傷。納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞后不再自由地分布于胞質(zhì)中，而是優(yōu)先附著于線粒體上，當(dāng)納米顆粒侵入到線粒體上，抗氧化防御能力即隨之改變，而抗氧化酶活性的降低可能是由于納米顆粒抑制了相關(guān)酶mRNA的表達(dá)[22]。另一方面，ZnO納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞后迅速分解釋放Zn2+，細(xì)胞內(nèi)的Zn2+含量提高，使線粒體功能損傷，產(chǎn)生ROS[26]，過量的ROS可能是ZnO納米顆粒重要的毒性機(jī)制之一。

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