朱萬龍， 余婷婷， 章 迪， 孫淙南， 戈 帆， 王政昆

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 昆明 650500)

褐色脂肪組織(Brown adipose tissue, BAT)是進(jìn)行非顫抖性產(chǎn)熱的主要部位，主要存在于小型哺乳動(dòng)物中，人和其他哺乳動(dòng)物在嬰兒期也會(huì)有少量存在[1]。然而最近的研究表明，成年人體內(nèi)的確存在有功能活性的BAT，此研究結(jié)果顛覆了以往傳統(tǒng)的觀念，被美國《時(shí)代周刊》評(píng)為2009年度十大醫(yī)學(xué)突破之一[2-4]。動(dòng)物在冷環(huán)境下BAT主要通過增加組織重量、線粒體蛋白含量[5]和UCP1的含量來增加產(chǎn)熱[6,7]。UCP1是位于褐色脂肪組織線粒體內(nèi)膜上的一種解偶聯(lián)蛋白，其功能誘導(dǎo)質(zhì)子漏產(chǎn)熱[8,9]。目前已從許多動(dòng)物中成功分離出UCP1蛋白，其基因結(jié)構(gòu)在鼠和人之間高度保守[10]，約有90%以上的氨基酸殘基相同[11]。

目前，關(guān)于UCP1基因的序列研究有很多[12-17]，然而關(guān)于UCP1基因在野生小型哺乳動(dòng)物中的研究還較少。本研究以橫斷山區(qū)固有類群大絨鼠(Eothenomysmiletus)為材料，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)從其BAT中提取UCP1 cDNA序列，并把該序列與其他物種進(jìn)行了同源性比較，為進(jìn)一步研究大絨鼠的UCP1基因和能量代謝提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用大絨鼠于2012年10月捕自云南省劍川縣石龍村海拔2590 m的農(nóng)田中(北緯26°15′～26°45′，東經(jīng)99°40′～99°55′)。年平均氣溫9.1 ℃，年平均最低溫度和最高溫度分別為-4.0 ℃和24.1 ℃，季節(jié)干濕分明[18]。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

動(dòng)物斷頸處死后，迅速分離BAT。BAT總RNA的提取與純化按照RNA-pure高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供方法進(jìn)行。cDNA第一鏈的合成以BAT 總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，按照M-MLV Frist Strand Kit試劑盒(Invitrogen Co.)提供方法進(jìn)行。

1.3 大絨鼠UCP1基因cDNA核心序列的擴(kuò)增

根據(jù)人(登錄號(hào): NM0033-55.2)、小家鼠(NM 0116-71.4)等已知脊椎動(dòng)物UCP1基因氨基酸序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對簡并引物：(UCP1F：CGGAATTCGAGCCAAGATGGTGAGT；UCP1R：CGGAATTCGTAGGTCCCAGTGTAGCG)，用以上引物為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。UCP1基因cDNA核心序列擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，53～58℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。UCP1基因cDNA核心序列的擴(kuò)增體系(50 μL)為：1 μL DNA模板(10 ng/μL)，5 μL 10×PCR Buffer，2 μL MgCl2(25 mmol/L)，1 μL dNTP Mixture(10 mmol/L，pH值8.0)，1 μL Primer 1 (10 pmol/μL)，1 μL Primer 2(10 pmol/μL)，0.5 μL Taq enzyme(4 U/μL，購自北京博邁德生物公司)，38.5 μL dd H2O。RT-PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至昆明碩陽科技有限公司進(jìn)行正反兩個(gè)方向的序列測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

對于獲取的UCP1 cDNA序列利用美國國家生物技術(shù)信息中心(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST軟件進(jìn)行同源性比對。用ClustaX1.81軟件進(jìn)行UCP1氨基酸序列比對排列，采用MEGA5軟件[12]中的ML法與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的不同物種的UCP1 cDNA序列采用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各分支的數(shù)值由1000次重復(fù)檢驗(yàn)所得；用ORF軟件(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/)推導(dǎo)編碼蛋白的氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 大絨鼠BAT總RNA提取

用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測大絨鼠BAT總RNA，電泳檢測顯示在250～2000 bp位置處有連續(xù)彌散狀，可作為模板用于后面的試驗(yàn)。

2.2 UCP1 RT-PCR產(chǎn)物的測序及分析

經(jīng)RT-PCR所得產(chǎn)物約為458 bp的大絨鼠UCP1 cDNA核心序列，包含的開放閱讀框?yàn)?56 bp，編碼151個(gè)氨基酸(圖1)。

圖1 大絨鼠UCP1基因cDNA部分序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

哺乳動(dòng)物登錄號(hào)氨基酸同源性(%)黑線倉鼠 Cricetulus griseusXP_003511983.199橙腹草原田鼠 Microtus ochrogasterXP_005369607.199金黃倉鼠 Mesocricetus auratusNP_001268261.198褐家鼠 Rattus norvegicusNP_036814.194小家鼠Mus musculusNP_033489.194突尼斯非洲跳鼠 Jaculus jaculus XP_004655890.186豚鼠 Cavia porcellusXP_003476876.187樹鼩 Tupaia chinensis ELW69185.183小馬島猬 Echinops telfairiNP_001268234.189蒙眼貂 Mustela putorius furo XP_004768520.186家貓 Felis catusXP_003985034.186大熊貓 Ailuropoda melanoleucaXP_002927036.185蘇門答臘猩猩 Pongo abeliiXP_002815208.285食蟹猴 Macaca fascicularisEHH53985.184牛 Bos TaurusXP_005217590.185水牛Bubalus bubalisAFS30900.180野駱駝 Camelus ferus EPY74185.181

2.3 UCP1氨基酸序列的同源性分析

通過BLAST搜索，所得大絨鼠UCP1氨基酸序列與嚙齒類、靈長類、食肉類和奇蹄類等的氨基酸序列同源性均在80%以上(表1)，它們氨基酸序列比對的一致性為85.15%(圖2)。而與魚和兩棲類UCP1氨基酸序列同源性低于61%(表2)。

*表示相同氨基酸

圖2大絨鼠UCP1氨基酸序列與黑線倉鼠、橙腹草原田鼠、金黃倉鼠、小家鼠、褐家鼠、小馬島猬、突尼斯非洲跳鼠、豚鼠、家貓、大熊貓、蒙眼貂、蘇門答臘猩猩、食蟹猴、牛、樹鼩、水牛和野駱駝的比對

Fig 2 Comparison amino acid residues ofEothenomysmiletusUCP1 with that ofCricetulusgriseus,Microtusochrogaster,Mesocricetusauratus,Musmusculus,Rattusnorvegicus,Echinopstelfairi,Jaculusjaculus,Caviaporcellus,Feliscatus,Ailuropodamelanoleuca,Mustelaputoriusfuro,Pongoabelii,Macacafascicularis,BosTaurus,Tupaiachinensis,BubalusbubalisandCamelusferus

2.4 UCP 1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將擴(kuò)增得到的UCP1序列與橙腹草原田鼠(XM_005369550.1)、小家鼠 (NM_009463.3)、大鼠Rat (M11814.1)、智人Homosapiens(NM_021833.4)、東非狒狒Papioanubis(XM_003899212.1)、白犀牛Ceratotheriumsimum(XM_004426473.1)、鯉魚Cyprinuscarpio(AY461434.2)和熱帶爪蟾Xenopus(Silurana)tropicalis(NM_001113882.1)的UCP1序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從圖3可以看出，UCP1雖然在進(jìn)化過程中高度保守，但也存在種屬特異性。大絨鼠與橙腹草原田鼠聚成一支，構(gòu)成田鼠類分支。

表2 大絨鼠與魚和兩棲類UCP1氨基酸序列同源性比較結(jié)果

圖3UCP1 cDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig 3 Evolutionary tree ofUCP1 cDNA sequence

3 討論

UCP1基因在哺乳動(dòng)物中高度保守[10]，之前的研究認(rèn)為UCP1的進(jìn)化是真獸類出現(xiàn)以后才出現(xiàn)的一種特殊的進(jìn)化過程[9]。直到在魚類中發(fā)現(xiàn)UCP1蛋白后，學(xué)者認(rèn)為UCP1蛋白并非像過去認(rèn)為的那樣，有可能是一種較為古老的蛋白[17]。有研究表明：從整個(gè)真獸類的進(jìn)化關(guān)系來看，UCP1通過正向選擇獲得產(chǎn)熱功能[13,19]。本研究對大絨鼠UCP1基因cDNA序列與哺乳類的UCP1基因cDNA序列的氨基酸同源性的研究表明，大絨鼠與哺乳動(dòng)物的氨基酸同源性在85%左右，說明UCP1基因在哺乳動(dòng)物中高度保守。其中與小型哺乳動(dòng)物氨基酸的同源性在90%左右，高于與大型哺乳動(dòng)物的氨基酸同源性80%。UCP1基因在小型哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出更高的保守性可能與UCP1的功能有關(guān)，小型哺乳動(dòng)物體型小，容易受到環(huán)境變化的影響，而UCP1介導(dǎo)的非顫抖性產(chǎn)熱是小型哺乳動(dòng)物適應(yīng)嚴(yán)寒環(huán)境的有效而經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)熱方式，在其維持體溫穩(wěn)定和能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。而大絨鼠UCP1氨基酸的同源性與魚和兩棲類的同源性比較低，在61%以下。然而關(guān)于UCP1基因在哺乳動(dòng)物中進(jìn)化機(jī)制仍然不清楚，需要進(jìn)一步研究。本研究利用大絨鼠UCP1序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹準(zhǔn)確定位了嚙齒類與靈長類、兩棲類和魚類的親緣關(guān)系，說明以UCP1序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹具有較高的可信度。從進(jìn)化樹中可以看出UCP1在進(jìn)化過程中高度保守，但也存在種屬特異性，大絨鼠與橙腹草原田鼠聚成一支，構(gòu)成田鼠類分支。

總之，本研究中以UCP1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹和與哺乳類、魚類和兩棲類氨基酸的同源性的比較發(fā)現(xiàn)，UCP1蛋白在哺乳類中高度保守，其介導(dǎo)的質(zhì)子漏產(chǎn)熱在一些小型哺乳動(dòng)物(尤其是嚙齒類)抵御寒冷環(huán)境中扮演重要的作用。

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