孫宗招，李帥，張寧，董敏敏，馮路平，許玉嬌，王樺

(曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東省生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東曲阜273165)

0 引言

由于過氧化物酶具有高效、專一的催化性能和溫和的反應(yīng)條件[1]，一直被廣泛應(yīng)用于多種有機(jī)底物的酶促反應(yīng)體系和生化檢測(cè)領(lǐng)域[2]。然而，常見的蛋白類過氧化物酶，如辣根過氧化物酶（HRP），在生物標(biāo)記和酶聯(lián)免疫分析過程中，存在易受外界環(huán)境條件的影響而失去活性問題，加之其昂貴的價(jià)格以及苛刻的儲(chǔ)存條件，大大限制了其在催化以及傳感檢測(cè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，尋找探索能夠替代蛋白酶的模擬酶和高效的酶促反應(yīng)體系以拓展其潛在的應(yīng)用前景仍然是當(dāng)今酶催化反應(yīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3～14]。

隨著納米技術(shù)的高速發(fā)展，納米材料在催化研究領(lǐng)域的應(yīng)用取得了一系列的研究成果[3～4]。許多具有類過氧化物酶活性的納米粒子不僅擁有納米小尺寸效應(yīng)，巨大比表面積，表面活性中心多等諸多特性，而且具有極強(qiáng)的酶催化反應(yīng)活性與催化效率。例如，中科院生物物理研究所閻錫蘊(yùn)研究小組首次報(bào)道了具有內(nèi)在過氧化物模擬酶活性的磁性氧化鐵納米粒子[5]。其后，各種各樣類酶催化活性的納米功能材料的研究雨后春筍般涌現(xiàn)，包括：碳納米管[6],碳點(diǎn)[7],氧化石墨烯[8],雙金屬合金納米結(jié)構(gòu)材料[9],二氧化鈰納米粒子[10],片狀和球狀FeS納米結(jié)構(gòu)材料[11],小尺寸金納米粒子[12]，血紅素-石墨烯雜交納米復(fù)合物[13]，以及牛血清白蛋白穩(wěn)定化的金納米簇[14]等。這些類過氧化物酶不僅制備簡(jiǎn)單、廉價(jià)、穩(wěn)定性高，而且具有抗變性和酶解特性，使其在酶催化應(yīng)用中比天然酶更具優(yōu)勢(shì)。

明膠是一種最常用的天然生物高分子，主要成分是膠原蛋白,已廣泛應(yīng)用于食品和藥品[15～16]。明膠具有可生物降解、無毒、和高生物相容性，特別是具有獨(dú)特的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換（臨界轉(zhuǎn)換溫度35℃）特性。以明膠作為穩(wěn)定劑和保護(hù)劑合成納米顆粒已有報(bào)道[17～19]。例如，Oluwatobi等[17]和Mahmoud等[18]分別利用明膠結(jié)合麥芽糖和檸檬酸鈉合成了小粒徑的納米銀。Kim研究組[19]結(jié)合電漿過程合成了抗白念珠菌的明膠納米銀。然而，這些方法大多需另加入還原劑，同時(shí)所合成的納米銀均未提及具有類過氧化物酶的催化特性。

研究工作以明膠為穩(wěn)定劑和還原劑，直接一鍋式反應(yīng)合成了具有過氧化物酶催化活性和高儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的明膠納米銀。該納米銀模擬酶能在常溫下處于凝固狀態(tài)，可克服常規(guī)銀合成法中存在的納米銀顆粒物催化活性以及穩(wěn)定性差等難題。同時(shí)，通過應(yīng)用于常見酶促反應(yīng)體系系統(tǒng)地考察了其過氧化物酶催化性能，并測(cè)定了其催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)，為納米銀模擬酶的催化應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市科瑞儀器有限公司），F(xiàn)A2004N電子分析天平（上海菁海儀器有限公司），Infinite M 200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司），UV-3600紫外可見光分析儀（日本島津公司）。

明膠，硝酸銀（AgNO3），3，3’，5，5’四甲基聯(lián)苯胺（TMB）,二甲基亞砜（DMSO）,檸檬酸（C6H8O7）,十二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）,過氧化氫（H2O2）均購(gòu)自Sigma公司；實(shí)驗(yàn)過程中使用的其它試劑均為分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 納米銀的制備

一定量的AgNO3溶液與不同濃度的明膠水溶液混合，37℃下溫育攪拌并避光反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行產(chǎn)物分離純化，于4℃冰箱或常溫下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 納米銀的過氧化物酶活性的測(cè)試

不同條件下制備的一定量（例如，72 μmol/L）納米銀加入到按一定比例配置的不同濃度的TMB和H2O2酶促反應(yīng)混合液中，于室溫下反應(yīng)不同時(shí)間（例如，20 min），然后在波長(zhǎng)652 nm處測(cè)量其相應(yīng)吸光度值。

2 結(jié)果與討論

為探究合成明膠納米銀的最適反應(yīng)條件，該實(shí)驗(yàn)分別考察了不同硝酸銀的用量，明膠的用量，反應(yīng)溫度，反應(yīng)pH值以及反應(yīng)時(shí)間的影響，通過將各種納米銀產(chǎn)物應(yīng)用于TMB-H2O2酶促反應(yīng)體系并測(cè)定其催化產(chǎn)物的吸光度值，系統(tǒng)地研究了納米銀最優(yōu)的合成反應(yīng)條件。

2.1 不同明膠用量對(duì)合成納米銀的影響

采用固定量的AgNO3（20 mmol/L，0.2 mL）分別與不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%，2%，3%，4%，5%）明膠進(jìn)行反應(yīng)，并測(cè)定了合成的納米銀產(chǎn)物的UV光譜，結(jié)果如圖1所示。由此可知，以不同濃度明膠合成的納米銀的最大UV吸收峰的位置基本一致（450 nm），表明制得的納米銀顆粒尺寸大小相近，但以4%明膠合成的納米銀其UV吸收峰值最大，即反應(yīng)獲得的納米銀的產(chǎn)率最高。此外，將所合成的納米銀分別用于TMB-H2O2酶促反應(yīng)體系，并測(cè)量催化反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值（圖2），結(jié)果表明，以4%明膠用量合成的納米銀催化產(chǎn)物的吸光度值最大，證明其催化H2O2氧化TMB的能力最大。因此，納米銀合成反應(yīng)中最佳明膠的用量為4%。

2.2 不同的AgNO3用量對(duì)合成納米銀的影響

圖1 不同用量的明膠合成的納米銀的紫外可見光譜反應(yīng)條件：20 mmol/L AgNO3分別與1%，2%，3%，4%，5%明膠混合，于37℃下溫育攪拌，避光反應(yīng)8 hFig.1 UV-vis spectraums of silver nanoparticles synthesised by different dosage of gelatin Reaction conditions:AgNO3(20 mmol/L)to be sepatrately mixed with 1%，2%，3%，4%，5%gelatin,incubated and stirred for 8 h at 37℃under the light-shaded condition

圖2 不同的明膠用量合成的納米銀的催化性能反應(yīng)條件：72 μmol/L不同納米銀，4.0×10-4mol/L TMB和9.0 mmol/L H2O2，室溫下反應(yīng)20 minFig.2 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised by different dosage of gelatin.(Inset shows the color changes of TMB-H2O2reactions catalyzed by silver nanoparticles)Reaction conditions:72 μmol/L silver nanoparticles,4.0×10-4mol/L TMB,9.0mmol/L H2O2,mixed at room temperature for 20 min

實(shí)驗(yàn)采用固定量的4%明膠與不同量的AgNO3反應(yīng)，并對(duì)獲得的納米銀產(chǎn)物進(jìn)行UV光譜分析（圖3）和催化反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)（圖4）。首先，由圖3可知，以不同濃度AgNO3合成的納米銀其UV吸收峰的形狀以及最大吸收峰的位置與面積有一定差別，反映對(duì)應(yīng)的納米銀顆粒的大小、形成量和光學(xué)性質(zhì)的差異性，其中，以6.67 mmol/L AgNO3合成的納米銀的UV吸收峰面積較大，而以5.71 mmol/L AgNO3制備的納米銀的吸收峰最高。其次，由圖4可知，不同條件下合成的納米銀對(duì)TMB-H2O2體系的催化反應(yīng)能力的差別也較大，當(dāng)AgNO3的使用濃度達(dá)5.71 mmol/L后，其催化能力趨于最大，繼續(xù)增加AgNO3的使用濃度，產(chǎn)物對(duì)TMB-H2O2體系催化反應(yīng)的能力變化不大。鑒此，實(shí)驗(yàn)選擇5.71 mmol/L AgNO3為合成納米銀的最優(yōu)濃度。

圖3 不同用量AgNO3合成的納米銀的紫外可見光譜反應(yīng)條件：4%明膠分別與1.82 mmol/L，3.33 mmol/L，4.62 mmol/L，5.71 mmol/L，6.67mmol/L，7.50 mmol/L AgNO3混合，于37℃下溫育攪拌并避光反應(yīng)8 hFig.3 UV-vis spectraums of silver nanoparticles synthesized by different dosage of AgNO3 Reaction conditions:4%gelatin separately mixed with 1.82 mmol/L,3.33 mmol/L,4.62 mmol/L,5.71 mmol/L,6.67 mmol/L and 7.50 mmol/L AgNO3,incubated and stirred for 8 h.at 37℃under the light-shaded condition

圖4 不同AgNO3用量合成的納米銀的催化性能反應(yīng)條件：同圖2Fig.4 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised by different dosage of AgNO3.(Inset shows the color changes of TMB-H2O2reactions catalyzed by silvernanoparticles)Reaction conditions:the same as in Fig.2

2.3 其它反應(yīng)條件（溫度、pH、時(shí)間）對(duì)合成納米銀的影響

圖5 不同溫度下合成的納米銀的催化性能反應(yīng)條件：合成時(shí)，4%明膠與5.71 mmol/L AgNO3混合，于不同溫度（4℃，25℃，37℃，65℃）下溫育攪拌并避光反應(yīng)8 h；催化反應(yīng)條件同圖2Fig.5 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised under different temperatures Reaction conditions:4%gelatin mixed with 5.71 mmol/L AgNO3,incubated at different temperature(4℃,25℃,37℃,65℃)under the light-protected condition and stired for 8 h;the catalytic reaction conditions as in Fig.2

實(shí)驗(yàn)考察了溫度、pH、時(shí)間等反應(yīng)條件對(duì)合成納米銀的影響。首先，采用在不同溫度（4℃,25℃,37℃,65℃）下反應(yīng)合成納米銀，并考察了其對(duì)TMB-H2O2體系的催化能力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，納米銀的最佳合成反應(yīng)溫度以37℃最佳并與人生理體溫一致。其次，實(shí)驗(yàn)研究了在不同pH下合成的納米銀對(duì)TMB-H2O2體系的催化反應(yīng)情況（圖6），結(jié)果表明，以中性或弱酸/弱堿的反應(yīng)條件較優(yōu)。最后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成納米銀的影響。圖7顯示了制得的納米銀對(duì)TMB-H2O2催化反應(yīng)體系催化結(jié)果，由此可知，合成反應(yīng)進(jìn)行8 h后合成反應(yīng)即可完成，所得到的納米銀產(chǎn)物的催化效率達(dá)到最大化。

綜上所述，根據(jù)酶催化效率最大化的標(biāo)準(zhǔn)，合成明膠納米銀的最優(yōu)反應(yīng)條件為：4%明膠，5.71 mmol/L AgNO3，于中性或弱酸弱堿條件下，在37℃避光反應(yīng)8 h。

2.4 納米銀的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性考察

圖6 不同pH值下合成的納米銀的催化性能反應(yīng)條件：合成時(shí)，4%明膠與5.71 mmol/LAgNO3混合，于37℃和不同pH值（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0）下溫育攪拌并避光反應(yīng)8 h；催化反應(yīng)條件同圖2Fig.6 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised at different pH values Reaction conditions:4%gelatin mixed with 5.71 mmol/L AgNO3,incubated at 37℃and different pH values(2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0);the catalytic reaction conditions as in Fig.2

圖7 不同反應(yīng)時(shí)間下合成的納米銀的催化性能反應(yīng)條件：合成時(shí)，4%明膠與5.71 mmol/L AgNO3混合，于37℃和pH7.0以及不同反應(yīng)時(shí)間（4，6，8，10，12 h）下溫育攪拌并避光反應(yīng)8 h；催化反應(yīng)條件同圖2Fig.7 The catalytic activities of silver nanoparticles synthesised at different reaction time Reaction conditions:4%gelatin mixed with 5.71 mmol/L AgNO3,incubated at 37℃,pH7.0 and different time(4,6,8,10,12 h);the catalytic reaction conditions as in Fig.2

目前，蛋白類過氧化物酶雖然催化活性高，但易于受環(huán)境條件干擾而失活。此外，常見方法合成的納米銀尚存在穩(wěn)定性較差的問題。該文考察了所制得的納米銀的穩(wěn)定性。將納米銀置放于室溫或4℃冰箱避光保存，每隔一段時(shí)間（2個(gè)月）取出一定量納米銀，并采用TMB-H2O2酶促反應(yīng)體系考察其催化活性，結(jié)果如圖8所示。由此可知，納米銀經(jīng)儲(chǔ)藏12個(gè)月，其催化活性仍變化不大，呈現(xiàn)極高的穩(wěn)定性。

圖8 明膠納米銀催化活性的穩(wěn)定性反應(yīng)條件：72 μmol/L納米銀（每隔2個(gè)月取出）,其它條件同圖2Fig.8 The catalytic activities of silver nanoparticles stored at different months Reaction conditions:72 μmol/L silver nanoparticles（taken out every two months）,the rest as in Fig.2

眾所周知，酶催化反應(yīng)的表觀穩(wěn)態(tài)常數(shù)Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)、酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。一般地，催化反應(yīng)的Km值愈大，酶與底物的親和力愈小，反之則親和力愈大，而酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度[20]。為了更進(jìn)一步闡明該納米銀模擬酶的催化性能和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，研究了納米銀模擬酶對(duì)催化反應(yīng)底物的表觀穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)，并采用米氏方程的雙倒數(shù)作圖法，對(duì)其Km值進(jìn)行了測(cè)定分析（即Lineweaver-Burk plot，也可稱為雙倒數(shù)方程）。將1／V對(duì)l／[c]作圖得到一條直線，該直線在Y軸的截距即為1／Vmax，在X軸上的截距即為1／Km的絕對(duì)值[21]。其中V是反應(yīng)速率，c是底物濃度。由此獲得的測(cè)定結(jié)果如圖9所示。

圖9 明膠納米銀的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的考察(a)TMB；(b)H2O2Fig.9 Investigation of Michaelis reaction dynamics of(a)TMB and(b)H2O2catalysized by silver nanoparticles

根據(jù)圖9求得的納米銀模擬酶對(duì)各底物的Km值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以H2O2為底物時(shí)，納米銀對(duì)應(yīng)的Km為50.12 mmol/L，而以TMB為底物時(shí)，納米銀對(duì)應(yīng)的Km為0.15 mmol/L。將之與文獻(xiàn)[5]中HRP對(duì)H2O2的Km值（3.7 mmol/L)和TMB的Km值（0.43 mmol/L)作比較，發(fā)現(xiàn)納米銀對(duì)H2O2底物Km比HRP的高，表明需要較高濃度H2O2以獲得最大反應(yīng)速度；而納米銀對(duì)TMB底物的對(duì)應(yīng)Km比文獻(xiàn)[5]報(bào)道的HRP的要低，表明相對(duì)于HRP該納米銀對(duì)底物TMB具有更高的親和力，即需要較低的TMB濃度以達(dá)到最大反應(yīng)速度。以上結(jié)果表明，該明膠納米銀具有與常規(guī)過氧化物酶（如HRP）相比擬的催化性能。

3 結(jié)論

該文利用明膠的穩(wěn)定性和還原性、特別是其獨(dú)特的溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)換（溫度35℃）特性，發(fā)展了綠色的一鍋式反應(yīng)合成具有類過氧化物酶催化性能的納米銀模擬酶。通過采用TMB-H2O2體系對(duì)其反應(yīng)催化底物的動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)的測(cè)定，表明了納米銀在過氧化氫檢測(cè)方面較常見蛋白酶（如HRP）的優(yōu)越性。此外，由于明膠常溫下處于凝固態(tài)，大于35℃才溶解成溶膠的奇異特性，使得制備的納米銀模擬酶具有更好的穩(wěn)定性（如便于保存，不易變質(zhì)等）。最重要的是，由于明膠外殼含有較多的羧基和氨基等功能基團(tuán)，不僅可提高納米銀的生物親和性，而且便于通過這些功能團(tuán)進(jìn)行各種化學(xué)修飾，從而使其在酶催化體系以及酶?jìng)鞲袡z測(cè)分析方面具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

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