徐運(yùn)妹，李丹，張玲，童海霞，楊蕊瓊，安振宇，李文杞

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004)

基于氧化石墨烯修飾的DNA生物傳感器用于苯酚的檢測(cè)

徐運(yùn)妹，李丹*，張玲，童海霞，楊蕊瓊，安振宇，李文杞

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410004)

作為一種典型的優(yōu)先控制污染物，苯酚一直是環(huán)境監(jiān)測(cè)和污染控制的重要對(duì)象?；谘趸┐蟮谋缺砻娣e、優(yōu)良的電子傳導(dǎo)性等特性，以其為橋梁，為DNA在玻碳電極上的固定提供了可能，并加大了DNA在電極上的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，由此而構(gòu)建了一種性能優(yōu)良的DNA生物傳感器。將該傳感器浸在含有苯酚的溶液中，由于苯酚對(duì)DNA的損傷作用，降低了DNA在電極上的電化學(xué)響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)信號(hào)與苯酚的濃度對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，響應(yīng)范圍為1．0×10－8～1．0×10－4mol/L，此外，該生物傳感器表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

苯酚；氧化石墨烯；DNA生物傳感器；電化學(xué)響應(yīng)

0 引言

自Watson和Crick［1］發(fā)現(xiàn)生物遺傳分子DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)以來(lái)，人們對(duì)于DNA的研究也越來(lái)越重視，尤其是對(duì)于DNA和其他物質(zhì)相互作用的研究［2］。目前對(duì)DNA與其它物質(zhì)作用的技術(shù)主要有光譜技術(shù)、表面分析技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)等一系列的方法［3～5］。其中，電化學(xué)技術(shù)主要用于檢測(cè)環(huán)境中的污染物等，其由于具有精確度和靈敏度高、特異性強(qiáng)、響應(yīng)和檢測(cè)迅速，操作簡(jiǎn)單、攜帶方便等一系列的優(yōu)點(diǎn)而備受人們關(guān)注。環(huán)境優(yōu)先污染物是對(duì)眾多有毒污染物進(jìn)行分級(jí)排隊(duì)，從中篩選出潛在危害大，在環(huán)境中出現(xiàn)頻率高的污染物作為監(jiān)測(cè)和控制對(duì)象，對(duì)于這類污染物的監(jiān)測(cè)稱為優(yōu)先監(jiān)測(cè)；它具有難以降解、在環(huán)境中有一定殘留水平、出現(xiàn)頻率高、具有生物積累性、屬于“三致”（致突變、致畸、致癌）物質(zhì)等特點(diǎn)［6～12］。水體中含有的許多無(wú)機(jī)、有機(jī)毒性污染物通過(guò)各種途徑進(jìn)入人體，由于其易于與DNA相互作用從而損傷DNA，導(dǎo)致生命學(xué)上的基因突變，繼而引發(fā)人體的各種病變乃至癌變，嚴(yán)重危害和威脅人類的生命健康［13～16］。

苯酚，又名石炭酸、羥基苯，是一種毒性較強(qiáng)的有機(jī)酚類化合物，并伴隨著較強(qiáng)的腐蝕性，有少數(shù)報(bào)道稱其有致癌的風(fēng)險(xiǎn)。苯酚是生產(chǎn)某些樹脂、殺菌劑、防腐劑以及藥物（如阿司匹林）的重要原料，在化工原料、烷基酚、合成纖維、塑料、合成橡膠、醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料、染料、涂料和煉油等工業(yè)中有著重要用途［17～20］。同時(shí)，苯在人體內(nèi)可代謝為苯酚、氫醌、苯醌等多種代謝產(chǎn)物。目前，研究這些有毒物質(zhì)與DNA相互作用的方法有體內(nèi)同位素前標(biāo)記法、體外加合物的研究［21］等，這些方法多在生物體內(nèi)或在體外細(xì)胞組織中進(jìn)行，由于毒性物質(zhì)組分的復(fù)雜性，單種毒物與DNA的相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不明確，不能考察單種毒物對(duì)DNA的損傷機(jī)制［22～25］。因此，從分子水平討論DNA與毒物的相互作用，可以更加準(zhǔn)確地闡明DNA損傷機(jī)制，為認(rèn)識(shí)致癌機(jī)制、有效治療癌癥提供依據(jù)［26］。該文通過(guò)循環(huán)伏安法、循環(huán)/差分脈沖伏安法、紫外光譜法、SEM研究了苯酚與DNA的相互作用。

石墨烯（Graphene）自2004年被英國(guó)曼徹斯特大學(xué)的教授Geim等［27］報(bào)道后，以其奇特的性能引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注和極大的興趣，被預(yù)測(cè)很有可能在很多領(lǐng)域引起革命性的變化。它作為一種新的形態(tài)，是sp2雜化碳原子組成的單層材料［27～32］。由于其有高比表面積、高電傳導(dǎo)性、室溫下極好的電子遷移率、高機(jī)械性能和靈活性，因此可以作為制備電化學(xué)傳感器和生物傳感器的一個(gè)理想材料［33～35］。將氧化石墨烯應(yīng)用于DNA生物傳感器的制備，以其為介質(zhì)，可以有效地將DNA吸附到電極表面并提高DNA在電極表面的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，從而制得性能優(yōu)良的DNA/GO/ GCE復(fù)合電極，并在此基礎(chǔ)上考查DNA與苯酚之間的相互作用［36～39］。這為低濃度苯酚的測(cè)定提供了一種有效的、快速的、準(zhǔn)確的方法和途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

KQ3200B型超聲波清洗器（上海司樂(lè)儀器有限公司），PHSJ－3F型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠），BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系列有限公司），10μL微量進(jìn)樣器（上海醫(yī)用激光儀器廠），CHI660A型電化學(xué)工作站（Gaoss Union），TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。三電極體系：217型雙鹽橋參比電極（甘汞電極，金屬為Hg，難溶鹽為Hg2Cl2（s），易溶鹽溶液為KCl溶液，電極可表示為Cl－/Hg2Cl2（s）/Hg，上?？祵庪姽饧夹g(shù)有限公司）；輔助電極（鉑金CHI115電極）；工作電極（玻碳電極）。

DNA（Sigma D－3159），氧化石墨烯（自制），0．05μm Al2O3（武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司），苯酚、NaH2PO4和Na2HPO4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)配置非生物試劑用水均為超純水，試驗(yàn)器皿和緩沖溶液均為經(jīng)高溫高壓滅菌。

1.2 玻碳電極的預(yù)處理

玻碳電極首先分別用3#、5#金相砂紙打磨10 min，用超純水沖洗后，用0．05μm Al2O3拋光粉沿著一個(gè)方向打磨10min，然后依次置于超純水、乙醇、超純水中各超聲清洗20min。將清洗好的電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀+0．1 mol/L KCl的溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法（CV）掃描，若曲線峰值差小于80mV且峰形穩(wěn)定，說(shuō)明該裸玻碳電極表面已清洗干凈，可以進(jìn)行電極修飾。

1.3 DNA/GO/GCE復(fù)合電極的制備

氧化石墨烯用超純水溶解，常溫下，超聲分散30min。用微量進(jìn)樣器吸取5μL的相應(yīng)濃度的氧化石墨烯溶液均勻地滴涂在處理好的玻碳電極表面，獲得GO/GCE電極，晾干。

將晾干好的電極置于pH=7．00的相應(yīng)濃度的DNA溶液中，以計(jì)時(shí)電流法施以+0．500 V的電壓將DNA有效地吸附到電極表面，持續(xù)時(shí)間200 s，獲得DNA/GO/GCE復(fù)合電極，取出，用超純水沖洗，晾干。

1.4 苯酚的檢測(cè)

將獲得的DNA/GO/GCE復(fù)合膜電極置于不同濃度的苯酚溶液中，靜置1 h。用循環(huán)/示差脈沖伏安法（DPV+Cyclic）進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯修飾電極的表征以及DNA/GO/ GCE復(fù)合電極的電化學(xué)行為

圖1為裸玻碳電極經(jīng)過(guò)氧化石墨烯修飾后的掃描電子顯微鏡（SEM）圖。從圖1可以看出，氧化石墨烯均勻地分散在玻碳電極表面，這為DNA的有效吸附以及電化學(xué)信號(hào)的放大提供了良好的平臺(tái)。

圖1 氧化石墨烯修飾電極的SEM圖Fig．1 SEM imageofgrapheneoxide－modified electrode

圖2為DNA/GO/GCE（ox）（圖2－b）電極和GCE（ox）電極（圖2－a）在0．1mol/LPBS緩沖溶液（pH=5．0）中的線性掃描伏安圖，從圖中可以看出DNA/GO/GCE（ox）電極在0．8 V和1．12 V兩處觀察到DNA特有的氧化峰，分別對(duì)應(yīng)于DNA中鳥嘌呤（G）和腺嘌呤（A）的氧化峰。圖2－a是未吸附DNA的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，GCE（ox）在0．8V和1．12V兩處沒有觀察到氧化電流峰。這表明通過(guò)恒電位吸附能使DNA成功固定于預(yù)處理的玻碳電極表面。

圖2 不同電極在0．1mol/LPBS緩沖溶液（pH=5．0）的線性掃描伏安圖（a：GCE（ox）；b：DNA/GO/GCE（ox）；DNA濃度：0．5mg/mL）Fig．2 The linear sweep voltammogramsofdifferent electrodes in 0．1mol/LPBSbuffer solution（pH=5．0）（a：GCE（ox）；b：DNA/GO/GCE（ox）；c（DNA）=0．5mg/mL）

2.2 最佳pH的選擇

被測(cè)溶液的pH值對(duì)DNA/GO/GCE復(fù)合電極的氧化催化活性有一定的影響，以6．0～7．5作為pH的考查范圍，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描，比較了0．1mmol/L的苯酚在不同pH的PBS緩沖溶液中的電化學(xué)響應(yīng)。從圖3和圖4中可以看出，當(dāng)pH為7．0時(shí)，電極的氧化峰電流達(dá)到最大，且峰電位未發(fā)生明顯偏移。故此分析體系選擇pH= 7．0的PBS緩沖溶液。

圖3 空白玻碳電極在不同pH的PBS緩沖溶液中的電位響應(yīng)曲線Fig．3 Blank glassy carbon electrode in PBSbuffer solutionofdifferentpH potentiometric response curve

2.3 最佳氧化石墨烯、DNA濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)考查了氧化石墨烯、DNA濃度對(duì)DNA/ GO/GCE復(fù)合電極電化學(xué)響應(yīng)的影響，考查的氧化石墨烯濃度范圍為0．2mg/m L～2mg/mL，DNA的濃度范圍為3mg/mL～7mg/mL。

從圖5和圖6中可以看出，當(dāng)石墨烯的濃度為1mg/mL、DNA的濃度為5mg/mL時(shí)，電極的氧化峰電流最大，且峰電位未發(fā)生明顯偏移。這是因?yàn)殡S著濃度的逐漸增大，電極上吸附DNA的量逐漸增多，但是玻碳電極的面積是固定的，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，吸附DNA的量達(dá)到了飽和，繼續(xù)加大石墨烯和DNA的濃度時(shí)，電極上吸附DNA的膜變厚，電極的導(dǎo)電性變差，抑制了DNA分子與電極表面的靜電作用，峰電流開始變低，故此分析體系選擇石墨烯的濃度為1 mg/mL、DNA的濃度為5mg/mL。

圖4 不同pH的PBS緩沖液與峰電流的關(guān)系曲線Fig．4 DifferentpH PBSbuffer and the peak currentcurve

圖5 不同濃度的石墨烯吸附DNA后在pH=7．0的PBS緩沖溶液中的電位響應(yīng)曲線Fig．5 Differentconcentrationsofgrapheneadsorption of DNA in pH=7．0PBSbuffer solution in the potentiometric response curve

圖6 不同濃度的DNA在pH=7．0的PBS緩沖溶液中的電位響應(yīng)曲線Fig．6 Potentiometric response curvesofdifferent concentration ofDNA in the pH=7．0PBSbuffer solution

圖7 0．1mmol/L的苯酚在DNA傳感器上的電位響應(yīng)曲線Fig．7 0．1mmoL/Lofphenolin thepotentialon the DNA sensor response curve

2.4 苯酚在DNA/GO/GCE復(fù)合電極上電化學(xué)行為、線性響應(yīng)范圍及重現(xiàn)性

圖7中，曲線（a）為DNA/GO/GCE復(fù)合電極在pH=7．0的PBS緩沖溶液中的脈沖伏安曲線，曲線（b）為DNA/GO/GCE復(fù)合電極在含有0．1mmol/L的苯酚的pH=7．0的PBS緩沖溶液中的對(duì)比圖，從圖中可以看出，苯酚的加入降低了DNA的鳥嘌呤和腺嘌呤在0．7 V和1．0V左右的氧化峰，因?yàn)楸椒悠茐牧薉NA分子的堿基對(duì)，該作用可體現(xiàn)在鳥嘌呤（G）和腺嘌呤（A）氧化峰電流降低這一電化學(xué)行為上。

圖8為DNA/GO/GCE復(fù)合電極在不同濃度的苯酚溶液中的脈沖伏安圖，如圖所示，不同濃度的苯酚對(duì)氧化峰電流改變量不同。當(dāng)苯酚濃度超過(guò)0．1mmol/L時(shí)，鳥嘌呤和腺嘌呤的氧化峰電流降至最低，繼續(xù)增大污染物的濃度到1×10－3mol/L時(shí)，DNA修飾電極對(duì)污染物沒有響應(yīng)了，因?yàn)楸椒訚舛鹊脑龃髸?huì)增加DNA分子的損傷程度，當(dāng)損傷達(dá)到飽和，DNA完全脫離電極表面時(shí)，使得電極在未氧化之前失去了活性，從而使DNA復(fù)合膜傳感器無(wú)法對(duì)其響應(yīng)。

從圖9可以看出，苯酚濃度在1×10－4～1×10－8mol/L范圍內(nèi)與DNA復(fù)合膜傳感器響應(yīng)，氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0．314 2 x+ 2．534 3，相關(guān)系數(shù)為0．995 9。

圖8 不同濃度的苯酚溶液在DNA復(fù)合膜傳感器上的電化學(xué)行為Fig．8 Differentconcentrationsofphenolin the electrochemicalbehaviorofDNA composite film sensor

圖9 DNA傳感器氧化峰電流與苯酚濃度關(guān)系Fig．9 DNA sensoroxidation peak currentand phenol concentration

從表1可以看出，電極具有較好的重現(xiàn)性，峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2．02%。

表1 DNA復(fù)合膜傳感器在pH=7.0的PBS緩沖液中的重復(fù)測(cè)定Tab.1 DNA composite film sensor reproducibility of the determ ination of pH=7.0 PBSbuffer

2.5 紫外光譜法研究苯酚與DNA的作用機(jī)理

圖10為在pH=7．0的PBS緩沖溶液中，采用紫外光譜法研究苯酚與DNA的作用，a曲線為pH=7．0的PBS緩沖溶液中含有1m L 0．05mg/mL的DNA的紫外可見吸收，b曲線為pH=7．0的PBS緩沖溶液中含有1 mL 0．05 mg/mL的DNA與1mL 0．1mmol/L的苯酚溶液的紫外可見吸收，從圖中可以看出，兩者均在260 nm左右有吸收，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，再加入污染物之后，吸光度值明顯降低了，同時(shí)最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移，這是由于在加入苯酚之后，污染物苯酚嵌入到了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，使得DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲等變化，因此，可以判斷出污染物苯酚與DNA的作用為嵌入作用。

圖10 苯酚與DNA作用紫外光譜圖Fig．10 UV spectrum of interaction phenolwith DNA

3 結(jié)論

該文提供了一種可以用于檢測(cè)苯酚的氧化石墨烯修飾的DNA生物傳感器，其制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、重現(xiàn)性好，顯現(xiàn)出良好的電化學(xué)傳感性能。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該DNA/GO/GCE傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)與苯酚的濃度對(duì)數(shù)在1．0×10－8～1．0×10－4mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0．995 9，檢測(cè)下限為1．0×10－8mol/L。該傳感器的測(cè)定環(huán)境為中性，這為實(shí)際水樣的檢測(cè)提供了便利，具有一定的理論和實(shí)際價(jià)值。但該傳感器也存在一定的缺陷，它不可重復(fù)使用，每次測(cè)定前都需重新對(duì)電極進(jìn)行處理，這將是以后的工作需要著重克服的難點(diǎn)。

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Based on graphe meoxide modified DNA biosensor for phenol detection

Xu Yun-mei，LiDan*，Zhang Ling，Tong Hai-xia，Yang Rui-qiong，An Zhen-yu，LiWen-qi
（Hunan Provincial Key Laboratory ofMaterials Protection for Electric and Transportation，SchoolofChem istry and Biological Engineering，Changsha University of Scienceand Technology，Changsha410004，China）

Asa typical priority pollutant，phenolhasalways been the importantobjectofenvironmentalmonitoring and pollution control．In the presentwork，we developed a biosensor for phenolmonitoring based on the composite film ofgraphene oxide and DNA．Graphene oxide provided large surface area for DNA immobilization and promoted the electrochemical response of immobilized DNA．Thus，a biosensor using DNA as transducer was constructed．When this biosensorwas immersed in phenol solution，the voltammetric response of DNA was decreased due to the interaction of phenolwith DNA．The signalof the biosensorwas linear to the concentration of phenol in the range of 1．0×10－8～1．0×10－4mol/L．Moreover，the biosensorshowed good stability and reproducibility．

phenol;grapheneoxide;DNA biosensor;electrochemical response

湖南省自然科學(xué)基金（12JJ3013，11JJ5010）、長(zhǎng)沙理工大學(xué)電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2013CL04），湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（2013NK3002，2011RS4069）

*通訊聯(lián)系人，E－mail：ld1004＠126．com，電話：0731－85258733