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(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090; 2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)
目前世界魷魚產(chǎn)量約230萬t,我國每年加工的魷魚原料達(dá)數(shù)萬噸之多。魷魚的可食部分占80%以上,幾種遠(yuǎn)洋魷魚的一般成分(干基含量)大約為:粗蛋白占18% ~ 20%,粗脂肪占1. 6% ~ 2. 0%,粗灰分占1. 5% ~ 1. 7%[1]。魷魚富含人體必需的多種氨基酸,是一種營養(yǎng)保健型且風(fēng)味良好的水產(chǎn)品資源[2]。
冷凍保藏在長期貯藏中能夠極大的保持魷魚的品質(zhì),一方面可以降低魷魚蛋白內(nèi)部自身的各類生化反應(yīng)速率,另一方面也可以降低微生物的繁殖速率。但是由于冰晶形成和肌肉組織中水分的重結(jié)晶,蛋白在凍藏過程中不可避免地發(fā)生冷凍變性,從而導(dǎo)致各項(xiàng)理化指標(biāo)的變化,最終影響產(chǎn)品的綜合品質(zhì)[3]。因此,為增加產(chǎn)品的附加值,提供優(yōu)質(zhì)鮮美的魚品,有必要研究常用保鮮劑對魷魚保水性以及蛋白質(zhì)變性的影響,通過添加保鮮劑以防止魷魚蛋白冷凍變性,提高魷魚的品質(zhì)。目前保鮮劑對凍藏魷魚品質(zhì)變化的研究甚少,李芳斐等[4]在殼聚糖對腌制魷魚防腐作用研究中指出,經(jīng)過殼聚糖涂膜處理的腌制魷魚比未經(jīng)殼聚糖涂膜處理的有一定的防腐抗菌作用。吳金龍等[5]使用從烏賊墨中提取的活性多糖對低溫儲(chǔ)藏的魷魚進(jìn)行處理,結(jié)果表明烏賊墨多糖對冷凍魷魚有較好的防腐抗菌作用。本實(shí)驗(yàn)選擇北太平洋魷魚,在 - 20℃下凍藏,添加D - 山梨醇、乳酸鈉、三聚磷酸鈉、混合磷酸鹽和海藻糖,分析魷魚感官、持水力、鹽溶性蛋白含量、活性巰基含量和Ca2+- ATPase活性的變化,探討不同保鮮劑對添加劑組魷魚和空白組魷魚品質(zhì)變化的影響,分析不同添加劑的效果,旨在為魷魚生產(chǎn)及加工利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
表2 魷魚凍藏中感官評分規(guī)則Table 2 Rules of sensory evaluation on the storage of squid
樣品 捕撈船于2012年12月在赤道公海區(qū)域捕撈,船上凍結(jié)后 - 20℃貯藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室, - 80℃貯藏備用。
食品保鮮劑:D - 山梨醇、乳酸鈉、三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉、焦磷酸鈉和海藻糖;考馬斯亮藍(lán) G - 250、5,5’二硫代雙(2 - 硝基苯甲酸)、三羥甲基氨基甲烷、腺苷 - 5′ - 三磷酸二鈉鹽·二水、鉬酸銨、三氯乙酸、馬來酸、抗壞血酸、無水乙醇,蒸餾水、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、濃硫酸等,以上藥品純度均為AR。
JYL - 350型絞肉機(jī) 上海九陽股份有限公司;MPR - 414F型冰箱 Sanyo,日本;均質(zhì)機(jī)IUL型 西班牙;高速冷凍離心機(jī)5810R型 Eppendorf,德國;質(zhì)構(gòu)儀TMS - Pro型 Food Technology Corporation 美國;Power Wave XS型微孔板分光光度計(jì) 美國;YP200N型電子天平 上海菁海儀器有限公司;DK_524型水浴鍋 上海晉理科學(xué)儀器有限公司。
對魷魚進(jìn)行流水解凍,去頭去皮去內(nèi)臟,只保留胴體,切小塊備用。每種保鮮劑選取3個(gè)不同濃度。保鮮劑溶液與魷魚比例為2∶ 1(V/m),浸泡10min后[6],瀝干裝袋密封,貯藏于( - 20±0. 1)℃冰箱中。共貯藏60d,每隔10d取樣進(jìn)行感官評價(jià),測定魷魚持水力、鹽溶性蛋白含量、活性巰基含量和Ca2+-ATPase含量。
1. 3. 1 感官評價(jià) 由于實(shí)驗(yàn)量過大,實(shí)驗(yàn)條件的限制,各指標(biāo)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間緊湊,無法對所有濃度進(jìn)行感官評價(jià),僅選取由濃度Ⅱ的各保鮮劑浸泡的魷魚進(jìn)行感官評價(jià)。參考A. Lugasi等[8]提出的感官評價(jià)方法并修改,由10名經(jīng)過訓(xùn)練的評價(jià)員組成感官評價(jià)小組,評分規(guī)則為:最好品質(zhì)(E);好品質(zhì)(A);中等品質(zhì)(B)和較差品質(zhì)(C),評價(jià)內(nèi)容包括表皮、氣味、粘液、彈性等。評分細(xì)則詳見表2。
表1 保鮮劑的添加量(%)Table 1 The amount of food additive(%)
1. 3. 2 持水力的測定 參考文獻(xiàn)[9]但略作修改,利用TMS - Pro型質(zhì)構(gòu)儀,采用濾紙加壓法(filter paper press method)進(jìn)行測定。取完整肉塊10. 0g置于10層濾紙上,另取10片濾紙置于其上,定壓100N壓5min,加壓前后分別稱重,記錄加壓前重量(W1)和加壓后重量(W2),則加壓條件下的持水力可以用加壓失水率Xp(pressing loss)表示:
式中:Xp- 加壓失水率,%;W1- 加壓前魷魚重量,g;W2- 加壓后魷魚重量,g。
1. 3. 3 鹽溶性蛋白含量的測定 魷魚用攪拌機(jī)絞碎,取5g裝入打漿袋中,并加入100mL 冰冷的0. 6mol/L KCl 溶液,放入均質(zhì)機(jī)內(nèi)勻漿2次,4℃條件下提取1. 5h,最后11000r/min下低溫(4℃)離心10min,得到上清液即為實(shí)驗(yàn)用鹽溶性蛋白溶液。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[10],用牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0. 0055x+0. 0036(R2=0. 9993),計(jì)算結(jié)果以mg/g表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
1. 3. 4 肌動(dòng)球蛋白的提取 魷魚絞碎后取5g,加入50mL冰冷的0. 6mol/L KCl(4℃),勻漿1次,放入4℃冰箱中提取1. 5h,然后離心(5000r/min,30min,0℃),取10mL上清液加入30mL冰冷的去離子水稀釋沉淀肌動(dòng)球蛋白,離心(5000r/min,20min,0℃),所得沉淀加入30mL冰冷的1. 2mol/L KCl溶液,在0℃攪拌30min,不溶部分再次離心(5000r/min,20min,0℃)[11]。所得肌動(dòng)球蛋白溶液用0. 6mol/L KCl調(diào)節(jié)濃度在4 ~ 6mg/mL。所得溶液備用,以測定活性巰基和Ca2+- ATPase的含量。
1. 3. 5 活性巰基含量的測定 1mL肌動(dòng)球蛋白中加入9mL 0. 2mol/L Tris - HCl 緩沖液(pH6. 8)?;旌暇鶆蚝笕?mL混合溶液,加入0. 4mL 0. 1% 5,5’二硫代雙(2 - 硝基苯甲酸)溶液,在40℃下反應(yīng)25min,溶液在412nm下測定吸光值??瞻子?. 6mol/L KCl溶液代替[11 - 12]。計(jì)算結(jié)果以10-5mol/g表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)二次。
1. 3. 6 Ca2+- ATPase活性的測定 參考萬建榮法[13]以及文獻(xiàn)[14]測定Ca2+- ATPase活性。酶反應(yīng)混合液組成如表3。
表3 Ca2+ - ATPase活性測定酶反應(yīng)混合液組成Table 3 An enzyme reaction mixture for investigating activity of Ca2+ - ATPase
進(jìn)行反應(yīng)時(shí),按表中混合液組成的配方,在試管中先將除ATP以外的其他成分混合好,將反應(yīng)混合物放于25℃水浴中,待ATP溶液最后加入時(shí),反應(yīng)即開始,反應(yīng)3min,加入3mL 15% TCA使反應(yīng)停止,然后11000r/min離心2min,取離心液4mL加入試管中,加入3mL Tris - MgCl2緩沖液(pH7. 5),搖勻后再加入3mL定磷試劑(20% VC:3mol/L H2SO4:3%鉬酸銨以等體積混合),然后在45℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min,在640nm下測其吸光度。空白組用15% TCA代替。標(biāo)準(zhǔn)曲線用預(yù)先在100℃干燥1h后置于干燥器中干燥冷卻的KH2PO4,配制成0. 5mmol/L的溶液制作,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0. 9193x+0. 0111(R2=0. 9998)。計(jì)算結(jié)果以1mg酶蛋白在1min內(nèi)生成的無機(jī)磷酸量μmol表示,即μmol/(min·mg),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用SPSS 19. 0進(jìn)行方差分析(p<0. 05)。
表4是各種保鮮劑添加濃度Ⅱ組的魷魚感官評分結(jié)果。從表4中可以看出,魷魚的感官評分指標(biāo)中最先出現(xiàn)變化的是粘液,其次是氣味,表皮和彈性的變化相當(dāng)。魷魚的品質(zhì)初始點(diǎn)均為最好,隨著凍藏時(shí)間的延長,感官評價(jià)逐漸下降,對照組在10d以后就失去最好品質(zhì),各保鮮劑組均在20d后失去最好品質(zhì),其中海藻糖組和乳酸鈉組在30d之后才失去最好品質(zhì),且海藻糖組的整體效果優(yōu)于乳酸鈉組。在60d時(shí),對照組的各項(xiàng)指標(biāo)評分均為較差,而各保鮮劑組在60d時(shí)都保持了中等品質(zhì),說明各保鮮劑均對魷魚的品質(zhì)有提高作用。
表4 各種保鮮劑對凍藏魷魚的感官變化的影響Table 4 The squid sensory score of adding different additives
圖1分別表示了濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組各保鮮劑對魷魚持水力的影響,魷魚持水力可以用失水率來表示,隨著凍藏時(shí)間的延長,失水率越高,說明持水力越差,失水率越低,則持水力越強(qiáng)。從圖中可以看出,隨著凍藏時(shí)間的延長,魷魚的持水力越來越差。各保鮮劑組與對照組相比差異性極顯著(p<0. 01),各保鮮劑對魷魚持水力影響程度由大到小排列分別為:海藻糖>混合磷酸鹽>D - 山梨醇>乳酸鈉>三聚磷酸鈉,且濃度Ⅲ對持水力效果最好,濃度Ⅱ次之,濃度Ⅰ最小,海藻糖、混合磷酸鹽和D - 山梨醇對提高魷魚持水力作用較好,分別提高了14. 83%、13. 63%、12. 27%。
圖1 各種不同濃度保鮮劑對魷魚持水力變化的影響Fig. 1 The effects of different concentration additives on squid water retention
肉的持水力即保水性、系水性,是指肌肉在受外力作用時(shí),如加壓、加熱、切碎、冷凍、解凍、腌制等加工或貯藏條件下,保持其原有水分與添加水分的能力。肉的持水力的實(shí)質(zhì)是肉的蛋白質(zhì)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),單位空間以物理狀態(tài)所捕獲的水分量的反映。捕獲水量越多,則持水力越大。肉的持水力直接關(guān)系到肉制品的出品率、嫩度和風(fēng)味,所以提高肉的持水力,在肉制品生產(chǎn)中具有十分重要的意義[15]?;旌狭姿猁}是肉制品生產(chǎn)中使用較多的保水劑,能改變肌原纖維蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠流變特性,提高鹽溶蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)凝膠保持水分和脂肪的能力,減少營養(yǎng)成分的損失,從而影響肉制品保水性、成品率[16]。彭亞鋒等[17]指出海藻糖對生物抗脫水作用與它的玻璃態(tài)形成有關(guān),玻璃態(tài)假說認(rèn)為,當(dāng)生物成分干燥時(shí),海藻糖緊密地包住相鄰的分子,形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相類似的碳水化合物玻璃體,其擴(kuò)散系數(shù)很低,分子運(yùn)動(dòng)和分子變性非常微弱,能夠使生物分子維持一定的空間結(jié)構(gòu)。
圖2 各種不同濃度保鮮劑對魷魚鹽溶性蛋白含量變化的影響Fig. 2 The effects of different concentration additives on squid salt soluble protein content
圖2分別表示了濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組各保鮮劑對魷魚鹽溶性蛋白含量的影響,隨著凍藏時(shí)間的增加,鹽溶性蛋白含量呈下降趨勢。從圖中可以看出,濃度Ⅲ組D - 山梨醇、乳酸鈉、三聚磷酸鈉、混合磷酸鹽、海藻糖的鹽溶性蛋白含量分別為4. 98、6. 43、4. 68、5. 96、6. 68mg/g,各保鮮劑組與對照組相比差異性極顯著(p<0. 01)。各保鮮劑對魷魚鹽溶性蛋白含量影響程度由大到小排列分別為:海藻糖>乳酸鈉>混合磷酸鹽>D - 山梨醇>三聚磷酸鈉,且添加濃度Ⅲ組的魷魚鹽溶性蛋白含量最高,濃度Ⅱ次之,濃度Ⅰ最低。在整個(gè)凍藏過程中,添加濃度Ⅲ的海藻糖鹽溶性蛋白含量下降了7. 91mg/g,對照組下降了12. 17mg/g,對照組的鹽溶性蛋白含量減少值是濃度Ⅲ的海藻糖鹽溶性蛋白含量減少值的1. 5倍,海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽對提高魷魚鹽溶性蛋白含量作用較好,分別提高了4. 26、4. 01、3. 54mg/g。
凍藏引起魚肉肌動(dòng)球蛋白(主要是肌球蛋白)的打開與伸展,暴露的非極性氨基酸與鄰近的類似基團(tuán)引起疏水相互作用,這個(gè)過程導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的變性。目前國內(nèi)對于淡水魚類蛋白冷凍變性的研究主要是通過對不同條件下魚肉中的Ca2+- ATPase活性、鹽溶性蛋白含量以及巰基數(shù)量等指標(biāo)的測定來分析淡水魚蛋白質(zhì)冷凍變性的程度[18]。在凍藏過程中,巰基氧化形成的二硫鍵會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈的聚合,從而降低其鹽溶性。海藻糖抗凍機(jī)理可能與普通的糖類相似,但是海藻糖比一般的糖類具有更優(yōu)越的生化保護(hù)作用和穩(wěn)定性,因?yàn)楹T逄蔷哂懈叩牟AB(tài)轉(zhuǎn)變溫度(Tg),包括較小的自由體積、受限制的分子流動(dòng)性和在貯存中抵抗相分離和結(jié)晶的能力。乳酸鈉既沒有甜味也無熱值,是一種GRAS食品添加劑,被廣泛用作防腐劑、水分保持劑等,劉欣[19]等研究表明,海藻糖、乳酸鈉的加入能較好地抑制凍藏墉魚魚糜蛋白的冷凍變性,表現(xiàn)在這2種物質(zhì)加入后,凍藏編魚魚糜的凝膠能力得到較好的維持,鹽溶性蛋白含量、Ca2+- ATPase活性和巰基含量的下降及表面疏水性的增加也得到很好的抑制,2種物質(zhì)的抗凍效果比傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑(蔗糖、D - 山梨醇)具有明顯的優(yōu)勢。
巰基是蛋白質(zhì)分子中最具反應(yīng)活性的基團(tuán)。圖3分別表示了濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組各保鮮劑對魷魚活性巰基含量的影響,由圖可知,隨著凍藏時(shí)間的增加,魷魚中活性巰基含量呈下降趨勢。下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使埋藏在分子內(nèi)部的疏基活性基團(tuán)暴露出來,導(dǎo)致活性巰基含量減少[20]。活性巰基的減少意味著分子間或分子內(nèi)的二硫鍵的形成,氫鍵和疏水鍵的形成掩蓋了在肌動(dòng)球蛋白分子內(nèi)的活性巰基。從圖中可以看出,各保鮮劑對魷魚活性巰基含量影響程度由大到小排列分別為:海藻糖>乳酸鈉>混合磷酸鹽>D - 山梨醇>三聚磷酸鈉,且添加濃度Ⅲ組的魷魚活性巰基含量最高,濃度Ⅰ最低,濃度Ⅱ介于二者之間。在整個(gè)凍藏過程中,添加濃度Ⅲ的海藻糖活性巰基含量下降了11. 75×10-5mol/g,對照組下降了18. 12×10-5mol/g,海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽對提高魷魚活性巰基含量作用較好,分別提高了6. 37×10-5、5. 27×10-5、4. 44×10-5mol/g。這些結(jié)果表明,保鮮劑的加入抑制了凍藏過程中蛋白質(zhì)中巰基的氧化和二硫鍵的形成。
圖3 各種不同濃度保鮮劑對魷魚活性巰基含量變化的影響Fig. 3 The effects of different concentration additives on squid active sulfydryl content
圖4分別表示了濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組各保鮮劑對魷魚Ca2+- ATPase活性的影響,從圖中可以看出,隨著凍藏時(shí)間的延長,濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的Ca2+- ATPase活性均呈下降趨勢。隨著冷凍時(shí)間的延長,由于蛋白質(zhì)分子與結(jié)合水的結(jié)合狀態(tài)被破壞,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生位移,蛋白質(zhì)變性,ATPase活性部位也發(fā)生變化,導(dǎo)致魚肌動(dòng)球蛋白Ca2+- ATPase活性下降,所以肌動(dòng)球蛋白Ca2+- ATPase活性也被廣泛用來作為魚肉蛋白變性的指標(biāo)。引起凍藏過程中魚肉肌原纖維蛋白質(zhì)Ca2+- ATPase活性下降的原因目前有以下幾種:Lian等認(rèn)為是由于冰晶的機(jī)械作用引起的,也有很多研究認(rèn)為是由pH下降引起的,還有更多的研究認(rèn)為,由于巰基氧化形成二硫鍵導(dǎo)致分子聚合是ATPase活性下降的主要原因[21]。各保鮮劑對魷魚Ca2+- ATPase活性影響程度由大到小排列分別為:海藻糖>乳酸鈉>混合磷酸鹽>D - 山梨醇>三聚磷酸鈉,且添加濃度Ⅲ組的魷魚Ca2+- ATPase活性最高,濃度Ⅰ最低,濃度Ⅱ介于二者之間,海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽對提高魷魚Ca2+- ATPase活性作用較好,分別提高了0. 72×10-2、0. 60×10-2、0. 50×10-2μmol/(min·mg)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明保鮮劑的加入對Ca2+- ATPase活性變化有影響。
由上述結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步猜想與論證,發(fā)現(xiàn)除感官指標(biāo)外,其他4個(gè)指標(biāo)間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。表5為海藻糖在濃度Ⅲ條件下各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)矩陣。
表5 凍藏魷魚在海藻糖(濃度Ⅲ)處理下各指標(biāo)的相關(guān)性Table 5 Correlation among parameters of the frozen squid with trehalose at Concentration Ⅲ
圖4 各種不同濃度保鮮劑對魷魚Ca2+ - ATPase活性變化的影響Fig. 4 The effects of different concentration additives on squid Ca2+ - ATPase activity
注:*表示顯著性水平為0. 01。
由表5可知,各指標(biāo)相關(guān)系數(shù)均大于0. 900以上,且都為極顯著相關(guān)性。同理可知,在其他實(shí)驗(yàn)條件下的各指標(biāo)間均存在極顯著性相關(guān)性,這可能與肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白發(fā)生冷凍變性引起結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。
D - 山梨醇、乳酸鈉、三聚磷酸鈉、混合磷酸鹽、海藻糖對凍藏期間魷魚的持水力、鹽溶性蛋白含量、活性巰基含量和Ca2+- ATPase活性均有提高作用,且濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組保鮮劑中,濃度Ⅲ組作用效果最好,各保鮮劑組與對照組相比差異性極顯著(p<0. 01)。其中海藻糖、混合磷酸鹽和D - 山梨醇對提高魷魚持水力作用較好,添加量分別為5%、0. 5%、1. 5%;海藻糖、乳酸鈉和混合磷酸鹽對提高魷魚鹽溶性蛋白含量、活性巰基含量和Ca2+- ATPase活性作用較好,添加量分別為5%、6%、0. 5%。
海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖殘基經(jīng)α - 1,1 鍵接的非還原二糖,海藻糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,化學(xué)惰性,無毒性,無色無臭,口感略帶甜味,低熱值,它具有不同于其它碳水化合物的獨(dú)特的生物學(xué)性質(zhì)。乳酸鈉既沒有甜味也無熱值。且這2種保鮮劑效果均由于D - 山梨醇,避免了“高糖、高熱”的消費(fèi)理念,有很重要的加工意義。
本次實(shí)驗(yàn)對魷魚保鮮劑驗(yàn)證溫度、濃度仍單一,且單一保鮮劑難以實(shí)現(xiàn)對魷魚綜合品質(zhì)的保持,所以保鮮劑對不同貯藏溫度、添加不同濃度保鮮劑條件下魷魚品質(zhì)的影響以及復(fù)合保鮮劑的研制需要進(jìn)一步的探討。
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