，，，，，

(1 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院特需保健科，山東 青島 266003； 2 大連醫(yī)科大學； 3 青島市市立醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD) 是以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統(tǒng)退行性病變。其主要的組織病理學特點是β-淀粉樣蛋白(Aβ) 在神經細胞外聚集沉淀形成老年斑以及tau 蛋白過度磷酸化造成微管損傷和神經纖維纏結。4-羥基壬烯酸(HNE)是氧化應激的一個重要指標，它的大量積累是神經退行性疾病(如AD、帕金森病)的一項病理特征[1]。硒是人體必需的微量元素之一。缺硒時腦硒含量所維持的時間遠遠長于其他任何器官，腦也是最后一個出現缺硒現象的器官[2-3]。研究結果顯示，硒缺乏與AD密切相關，AD病人硒的攝入與正常人相比明顯偏低，且血清、紅細胞和指甲中硒含量也明顯降低[4]。本研究應用不同濃度的亞硒酸鈉對人神經母細胞瘤細胞進行處理，旨在探討硒對Aβ產生的影響?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)和穩(wěn)定表達淀粉樣前體蛋白(APP)的人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y/swAPP)購于上海細胞庫。將兩種細胞置于含體積分數0.06的CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)6～8 d。

1.2 酶活性的測定

將SH-SY5Y細胞首先用不同濃度的亞硒酸鈉(0、50、100和200 nmol/L)處理24 h，接著再用10 μmol/L的HNE處理24 h后收獲細胞。采用直接熒光法，用連有報告分子EDANS和DABCYL具有酶特異性的肽段檢測α-、β-、γ-分泌酶活性，操作按說明書步驟進行。試劑盒購自R&D System公司。

1.3 Aβ的檢測

將SH-SY5Y或者SH-SY5Y/swAPP細胞先用不同濃度亞硒酸鈉處理24 h，接著用10 μmol/L HNE處理24 h，然后在4 ℃下以14 000 r/min離心10 min，取100 μL樣品用于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。用human β-amyloid 1-40/1-42 ELISA試劑盒(購自美國Bio Source公司)檢測SH-SY5Y/swAPP細胞中的Aβ-40和Aβ-42。用雙抗體夾心ELISA試劑盒(美國IBL公司)檢測SH-SY5Y細胞中的分泌型β-淀粉樣蛋白(sAPPβ)。操作按說明書步驟進行。

1.4 淀粉蛋白前β位分解酶1(BACE1)蛋白檢測

將SH-SY5Y細胞先用不同濃度的亞硒酸鈉處理24 h，然后用10 μmol/L的HNE處理6 h。采用Western Blotting 方法，用ECL蛋白質印跡檢測系統(tǒng)檢測BACE1蛋白，按說明書進行操作。

1.5 BACE1 mRNA的檢測

用RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取SH-SY5Y細胞中RNA，按照說明書合成cDNA(試劑盒購自美國Promega公司)，采用Real-time PCR(試劑盒購自Takara公司)進行DNA的擴增。用于BACE1擴增的引物序列如下：正向5′-GCCAAGAAAGATGTTTGAAGCT-3′，反向5′-GCCAGAAACCATCAGGGAACT-3′。用于β-肌動蛋白擴增引物序列為：5′-AGGCCAACCGCGAGAA-G-3′，5′-ACGCCTGGATAGCAACGTACAT-3′。具體操作按說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 亞硒酸鈉對HNE處理后細胞中α-、β-、γ-分泌酶活性的影響

亞硒酸鈉可以降低β-、γ-分泌酶活性，表現出劑量依賴性(F=31、16，P<0.05)，但亞硒酸鈉對α-分泌酶活性沒有影響(P>0.05)。見表1。

2.2 亞硒酸鈉對HNE介導Aβ表達的影響

經亞硒酸鈉預處理，由HNE介導的sAPPβ表達明顯降低(F=56，P<0.01)；亞硒酸鈉預處理也能夠明顯降低由HNE介導的Aβ-40和Aβ-42的表達(t=13、12,P<0.01)。見表2。

2.3 亞硒酸鈉對HNE處理后BACE1表達的影響

HNE介導的BACE1蛋白和mRNA表達受到了亞硒酸鈉的影響而顯著下調(F=9 161、213，P<0.01)。見表3。

亞硒酸鈉濃度(c/nmol·L-1)α-分泌酶β-分泌酶γ-分泌酶 0100.0±6.4100.0±3.4100.0±11.750104.0±6.896.6±5.288.3±6.7100112.0±4.886.2±6.683.3±9.0200113.3±8.182.8±6.976.7±10.0

表2 亞硒酸鈉對HNE介導的sAPPβ、Aβ-40、Aβ-42表達的影響

亞硒酸鈉濃度(c/nmol·L-1)BACE1蛋白HNE(-)HNE(+)BACE1 mRNAHNE(-)HNE(+) 0100.0±0.8131.4±1.5100.0±0.1287.0±7.350101.4±1.777.1±1.6108.7±21.2113.0±2.310097.1±2.284.3±1.991.3±17.3147.8±19.2200111.4±1.540.0±0.9104.3±16.5160.9±34.6

3 討 論

AD的臨床改變主要與大腦皮質及邊緣神經系統(tǒng)的退行性改變有關，如海馬和新皮質的彌散性神 經元缺失、細胞內神經纖維纏結及細胞外淀粉斑沉積和神經元末梢變性[5]。Aβ在神經細胞外聚集沉淀是AD的重要病理特征之一；tau 蛋白過度磷酸化所造成的微管損傷及神經纖維纏結是AD的另一重要病理特征。流行病學研究還顯示，低教育程度、膳食因素、女性雌激素水平降低、高糖血癥、高膽固醇血癥、高同型半胱氨酸血癥、血管因素、心理社會因素等均與AD相關。

BACE1是產生Aβ的限速酶，其活性水平決定APP的代謝途徑。BACE1是一類天冬氨酰蛋白酶，其基因定位于人染色體11q23.2，全長共2 526個堿基對，包含9個外顯子。Aβ是老年斑的主要組成成分，它的過量產生及聚集是導致AD發(fā)病的主要原因。Aβ由Ⅰ型跨膜的APP經分泌酶水解代謝產生。分泌酶按作用位點可分為α-、β-和γ-等3種，Aβ由β-和γ-分泌酶依次水解APP而產生，具有毒性[6]；α-和γ-分泌酶依次水解APP，產生的可溶性sAPPα肽和P3肽段則具有神經營養(yǎng)等作用。若APP的α-和β-代謝失去平衡，產生過多的Aβ，就容易誘發(fā)AD。目前，可以減少Aβ產生的藥物的研究不多。周麗蘋等[7]的研究表明，人參皂苷Rg1可以阻斷Aβ25-35所致小鼠海馬神經元損傷，具有神經保護作用。

脂質過氧化水平的升高是AD發(fā)生的早期改變，其主要產物HNE對神經元具有毒性作用[8-9]。HNE的神經毒性可以直接攻擊蛋白質，引起酶活性減弱、基因突變以及細胞代謝紊亂，最終導致細胞死亡[10]。同時，HNE也可通過對膜脂質過氧化介導的DNA繼發(fā)性損傷或DNA的直接損傷引起神經細胞凋亡[11]。HNE和Aβ的產生具有相互促進的關系，Aβ 本身能誘導神經細胞膜脂質過氧化和產生HNE，反過來，培養(yǎng)的神經細胞暴露于HNE，其BACE1 表達增高，從而裂解APP 生成Aβ[12-13]。

硒是人體所必需的微量元素之一。以往調查顯示，長期處于低硒水平地區(qū)的人群與低認知功能相關聯[14]。然而，硒與AD關系的研究結果仍存在分歧，部分研究顯示，硒缺乏與AD的發(fā)病密切相關，補充含硒混合物可以改善認知功能[4,15]；另有研究顯示，AD病人與健康對照的腦脊液和血清中硒水平沒有明顯差異，AD病人海馬區(qū)或腦杏仁核區(qū)硒水平顯著升高，硒水平與AD病人腦脊液中的Aβ-42水平無關[16-18]。多數實驗結果表明，硒和硒蛋白與Aβ產生和脂質過氧化密切相關，硒缺乏的直接后果是硒蛋白的產生減少，抗氧化應激能力降低，進而使細胞發(fā)生氧化應激并促進AD的形成[19]。tau蛋白過度磷酸化是AD發(fā)病的機制之一，PP2A為絲氨酸和蘇氨酸特異性磷酸酯酶，它在保持和調節(jié)tau蛋白磷酸化平衡中發(fā)揮關鍵作用[20]。PP2A活性與人腦中tau蛋白的磷酸化水平呈負相關，含硒化合物能提高PP2A活性，通過降低tau蛋白的過度磷酸化而減少神經纖維纏結[21]。

本研究結果顯示，亞硒酸鈉能夠顯著降低由HNE誘導的β-和γ-分泌酶的活性，從而減少由分泌酶途徑產生的Aβ，但亞硒酸鈉對α-分泌酶的活性沒有影響；并且亞硒酸鈉也可直接減少由HNE誘導的sAPPβ和Aβ的產生；此外，亞硒酸鈉也可抑制由HNE誘導的BACE1的表達，進一步減少Aβ的產生。本文結果為應用硒化合物限制Aβ的產生從而治療AD提供了理論基礎。

[參考文獻]

[1]YIN S T, TANG M L, DENG H M, et al. Epigallocatechin-3-gallate induced primary cultures of rat hippocampal neurons death linked to Calcium overload and oxidative stress[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2009,379(6):551-564.

[2]SAVASKAN N E, UFER C, KUHN H, et al. Molecular biology of glutathione peroxidase 4: from genomic structure to developmental expression and neural function[J]. Biol Chem, 2007,388(10):1007-1017.

[3]CALABRESE V, GUAGLIANO E, SAPIENZA M, et al. Redox regulation of cellular stress response in aging and neurodegenerative disorders: role of vitagenes[J]. Neurochem Res, 2007,32(4/5):757-773.

[4]CARDOSO B R, ONG T P, JACOB-FILHO W, et al. Nutritional status of Selenium in Alzheimer’s disease patients[J]. Br J Nutr, 2010,103(6):803-806.

[5]CAPPAI R, WHITE A R. Amyloid beta[J]. Int J Biochem Cell Biol, 1999,31:885-889.

[6]李守業(yè),朱妍,焦悅,等. 阿爾采末病APP分泌酶及其靶向干預研究進展[J]. 中國藥理學通報, 2011,27(10):1349-1353.

[7]周麗蘋,葛科立,陳文芳. 人參皂苷Rg1對Aβ25-35致小鼠海馬神經元損傷保護作用[J]. 青島大學醫(yī)學院學報, 2011,47(3):189-191.

[8]HARDY J, SELKOE D J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science, 2002,297(5580):353-356.

[9]FLORANG V R, REES J N, BROGDEN N K, et al. Inhibition of the oxidative metabolism of 3,4-dihydroxyphenylacetaldehyde, a reactive intermediate of dopamine metabolism, by 4-hydroxy-2-nonenal[J]. Neurotoxicology, 2007,28(1):76-82.

[10]JOHNSON M D, XIANG H, LONDON S, et al. Evidence for involvement of Bax and p53,but not caspases,in radiation-induced cell death of cultured postnatal hippocampal neurons[J]. J Neurosci Res, 1998,54(6):721-733.

[11]ZHU M Y, WANG W P, BISSETTE G. Neuroprotective effects of agmatine against cell damage caused by glucocorticoids in cultured rat hippocampal neurons[J]. Neuroscience, 2006,141(4):2019-2027.

[12]MARK R J, LOVELL M A, MARKESBERY W R, et al. A role for 4-hydroxynonenal, an aldehydic product of lipid pero-xidation, in disruption of ion homeostasis and neuronal death induced by amyloid beta-peptide[J]. J Neurochem, 1997,68(1):255-264.

[13]TAMAGNO E, BARDINI P, OBBILI A, et al. Oxidative stress increases expression and activity of BACE in NT2 neurons[J]. Neurobiol Dis, 2002,10(3):279-288.

[14]GAO S, JIN Y, HALL K S, et al. Selenium level and cognitive function in rural elderly Chinese[J]. Am J Epidemiol, 2007,165(8):955-965.

[15]CORNELLI U. Treatment of Alzheimer’s disease with a cholinesterase inhibitor combined with antioxidants[J]. Neurodegener Dis, 2010,7(1/3):193-202.

[16]MESEGUER I, MOLINA J A, JIMENEZ-JIMENEZ F J, et al. Cerebrospinal fluid levels of Selenium in patients with Alzheimer’s disease[J]. J Neural Transm, 1999,106(3/4):309-315.

[17]LEITE R, JACOB-FILHO W, SAIKI M, et al. Determination of trace elements in human brain tissues using neutron activation analysis[J]. Journal of Radioanalytical and Nuclear Che-mistry, 2008,278(3):581-584.

[18]STROZYK D, LAUNER L J, ADLARD P A, et al. Zinc and Copper modulate Alzheimer Abeta levels in human cerebrospinal fluid[J]. Neurobiol Aging, 2009,30(7):1069-1077.

[19]LOVELL M A, XIONG S, LYUBARTSEVA G, et al. Organoselenium (Sel-Plex diet) decreases amyloid burden and RNA and DNA oxidative damage in APP/PS1 mice[J]. Free Radic Biol Med, 2009,46(11):1527-1533.

[20]LOEF M, SCHRAUZER G N, WALACH H. Selenium and Alzheimer’s disease: a systematic review[J]. J Alzheimers Dis, 2011,26(1):81-104.

[21]VAN EERSEL J, KE Y D, LIU X, et al. Sodium selenate mitigates tau pathology, neurodegeneration, and functional deficits in Alzheimer’s disease models[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(31):13888-13893.