，，，，

(1 青島大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山東 青島 266021；2 青島大學醫(yī)學院藥理學教研室； 3 青島市婦女兒童醫(yī)療保健中心檢驗科)

多糖是生物體內(nèi)重要的生物大分子，幾乎一切重要的生命活動過程都有糖的參與。隨著海洋藥物的興起，對海洋多糖的活性研究已經(jīng)成為目前藥物研究的熱點[1-2]。新近研究結(jié)果表明，多種海洋多糖具有保護多巴胺能神經(jīng)元的作用[3-4]。但關(guān)于海洋貝類多糖神經(jīng)保護活性的研究則鮮有報道。扇貝是一種極具開發(fā)潛力的海洋中藥材[5]。扇貝裙邊糖胺聚糖(SS-GAG)是從海洋貝類櫛孔扇貝裙邊中提取的活性成分，具有較強清除自由基、抗氧化應激作用[6-8]，能抑制6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的下降，具有抑制細胞凋亡的功效[9]。本研究探討SS-GAG對SH-SY5Y細胞丙二醛(MDA)含量、乳酸脫氫酶(LDH)活性及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、Caspase-9表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SS-GAG，由青島大學醫(yī)學院藥理學教研室提供，用無血清DMEM配制成溶液；MDA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；LDH試劑盒購自寧波瑞源生物科技有限公司；RIPA細胞裂解液購自北京索萊寶生物科技有限公司；RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、實時熒光(real-time)PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄擴增試劑盒購自杭州博日科技有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成；CaspGLOWTM活化Caspase-9熒光染色試劑盒由美國eBioscince公司提供；SH-SY5Y細胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)學院細胞中心；DMEM/HIGH GLUCOSE購自Thermo Hyclone公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞用含體積分數(shù)0.10胎牛血清(由杭州四季青公司提供)、含有100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液，在含有體積分數(shù)0.05的 CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞消化后，以2×109/L密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1.5 mL。隨機分為對照組(A組)、6-OHDA損傷組(B組)和用SS-GAG(200、400和800 mg/L)處理組(C、D、E組)，每組設(shè)3個復孔。培養(yǎng)24 h，對照組和6-OHDA損傷組加入無血清培養(yǎng)基，SS-GAG(200、400和800 mg/L)處理組分別加入200、400和800 mg/L的 SS-GAG，24 h后，6-OHDA損傷組和SS-GAG處理組加入終濃度為100 μmol/L的6-OHDA進行損傷，對照組不做任何處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2MDA含量和LDH活性測定 培養(yǎng)結(jié)束后，刮取細胞于1.5 mL的EP管中，加入細胞裂解液裂解細胞，用酶標儀按試劑盒說明進行MDA含量檢測。取20 μL細胞培養(yǎng)液，按LDH試劑盒說明進行操作，采用全自動生化分析儀檢測LDH活性。

1.2.3細胞Bcl-2、Bax mRNA相對表達水平檢測采用real-time PCR方法。用RNAiso試劑提取細胞總RNA。取1 μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，以cDNA為模板進行SYBR Green定量PCR擴增，GAPDH作為內(nèi)參。引物分別為：Bcl-2正向5′-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3′，反向5′-GGTGCCGGTTCAGGTACTCA-3′，擴增片段長度為120 bp；Bax正向5′-CCAGCTGCCTTGGACTGTGT-3′，反向5′-GGTTTATTACCCCCTCAAGACCAC-3′，擴增片段長度為143 bp；GAPDH正向5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，反向5′-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3′，擴增片段長度為206 bp。反應體系10 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45次循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。熒光值用Ct值表示，應用2-△△Ct法計算細胞Bcl-2、Bax mRNA相對表達水平。

1.2.4活化Caspase-9蛋白的表達檢測 采用流式細胞技術(shù)(FCM)，操作按照試劑盒說明書步驟進行，重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組MDA含量和LDH活性比較

與對照組比較，6-OHDA損傷組細胞MDA含量及LDH活性均明顯上升；與6-OHDA損傷組比較，各濃度SS-GAG組MDA含量及LDH活性水平均降低；隨SS-GAG濃度增高，細胞LDH活性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(F=39.014、405.261，P<0.01)。見表1。

表1 各組MDA含量和LDH活性比較

2.2 各組Bcl-2和Bax mRNA相對表達水平比較

與對照組相比較，6-OHDA損傷組細胞Bcl-2 mRNA表達明顯降低，Bax mRNA表達明顯升高;與6-OHDA損傷組比較，各濃度SS-GAG組Bcl-2 mRNA表達升高，Bax mRNA表達降低，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,差異均有顯著性(F=44.881、27.699，P<0.01)。見表2。

2.3 各組活化Caspase-9表達比較

與對照組細胞相比較，6-OHDA損傷組表達活化Caspase-9蛋白的細胞數(shù)明顯增多，表達未活化Caspase-9蛋白的細胞數(shù)減少；與6-OHDA損傷組比較，各濃度SS-GAG組表達活化Caspase-9蛋白的細胞數(shù)減少，表達未活化Caspase-9蛋白的細胞數(shù)增多，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，差異有顯著性(F=280.567，P<0.01)。見表3、圖1。

組別Bcl-2BaxA組1.00 1.00 B組0.04±0.0115.94±2.34C組0.28±0.0712.60±1.42D組0.45±0.2111.20±1.85E組0.71±0.099.43±1.41

組別未活化的Caspase-9活化的Caspase-9A組88.58±0.975.72±0.68B組11.67±1.3468.30±1.40C組24.43±1.7558.07±4.04D組64.31±2.8223.41±2.52E組77.37±3.9411.27±4.17

圖1 各組SH-SY5Y細胞中活化Caspase-9表達FCM檢測

3 討 論

大量研究表明，氧化應激通過多種途徑引起黑質(zhì)DA神經(jīng)元的凋亡或死亡[10]，6-OHDA可通過介導細胞內(nèi)外的氧化反應產(chǎn)生活性氧和醌類物質(zhì)，誘導單胺氧化酶產(chǎn)生過氧化氫及對線粒體呼吸鏈的直接抑制等引發(fā)氧化應激反應，最終引發(fā)DA神經(jīng)元細胞凋亡[11]。

MDA是衡量細胞氧化損傷水平的重要指標。過多的氧自由基會直接攻擊生物膜脂質(zhì)分子中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生代謝物MDA，其含量多少可直接反映機體脂質(zhì)過氧化的程度。氧化應激導致細胞損傷時，細胞膜完整性遭到破壞，細胞通透性增加，LDH從胞質(zhì)中釋放出來，可通過測定培養(yǎng)液中LDH的活性反映細胞的完整性[12]。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)6-OHDA誘導的細胞中MDA含量高于對照組，LDH的活性也明顯高于對照組，而各濃度SS-GAG組MDA含量及LDH活性均降低，說明SS-GAG可抑制細胞氧化應激水平，保護生物膜的完整性。

本課題組前期研究結(jié)果表明，SS-GAG能抑制6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的下降，抑制細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性，是細胞凋亡調(diào)控基因的重要成員之一[13]，抗凋亡基因 Bcl-2可通過阻滯凋亡信號途徑而抑制凋亡的發(fā)生，在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[14]。Bcl-2和Bax表達的改變，能觸發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道開放，誘導線粒體膜電位下降，促進細胞凋亡[15-16]。Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中也起著非常重要的作用，其中Caspase-9是級聯(lián)酶的上游分子，在正常狀態(tài)下以無活性的酶原形式存在，當細胞發(fā)生凋亡時，線粒體向細胞質(zhì)釋放的細胞色素激活Caspase-9，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡[17-20]。本文結(jié)果顯示， SS-GAG能夠升高6-OHDA損傷細胞的Bcl-2 mRNA表達，降低Bax mRNA表達。本課題組前期采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測顯示，SS-GAG能降低Bax mRNA的表達，但差異無統(tǒng)計學意義[9]。而本文采用real-time PCR技術(shù)檢測顯示，與6-OHDA損傷組相比較，各濃度SS-GAG組Bax mRNA表達降低，活化Caspase-9蛋白的表達同時減少。

綜上所述，SS-GAG能降低6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激水平，保護生物膜的完整性。通過上調(diào)Bcl-2基因的表達和下調(diào)Bax基因的表達，抑制線粒體膜電位的下降，抑制Caspase-9蛋白的活化，從而抑制6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，對DA神經(jīng)元具有重要的保護作用。

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