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(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，山東 青島 266021)

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)正常生理情況下其活性不表達，而在病理情況下一些細胞因子可將其激活，如白介素-1、腫瘤壞死因子可以激活NF-κB、蛋白激酶等，進一步誘導(dǎo)iNOS 表達而引起NO合成增加[1]。研究結(jié)果顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程主要是通過上調(diào)iNOS活性、引起NO合成增加來實現(xiàn)的[2-4]。綠茶內(nèi)含有茶多酚，其主要活性成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。研究證實，綠茶及其提取物具有預(yù)防及抗癌的作用。然而，EGCG是否對人肺腺癌A549細胞有抑制作用，其抑制作用是否與iNOS表達有關(guān)系尚未見文獻報道。因此，本實驗主要研究EGCG對人肺腺癌細胞株A549細胞抑制作用及其與iNOS表達量的關(guān)系，為EGCG用于臨床肺癌的治療奠定實驗基礎(chǔ)。 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

A549細胞由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室提供，EGCG購自美國Sigma公司，一抗iNOS(兔抗人多克隆抗體)購自美國Abcam公司，二抗購自博奧森GS公司，RNA抽提試劑盒及RT-PCR試劑盒購自大連Takara公司；iNOS和GADPH內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 引物

根據(jù)NCBI基因序列及Primer 5.0軟件設(shè)計iNOS、GAPDH 引物，引物序列見表1。

1.3 實驗方法

1.3.1A549細胞培養(yǎng)及細胞增殖活性測定 將人肺腺癌A549細胞置于含有體積分數(shù)為0.01胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、擴增。取指數(shù)生長期細胞，計數(shù)并取相同細胞密度接種于96孔板。隨機分為對照組和EGCG組，12 h后EGCG組分別加入不同濃度的EGCG，對照組加入等體積的無血清DMEM-1640培養(yǎng)液，每組設(shè)5個平行孔。24 h后用酶標(biāo)免疫測定儀測定波長490 nm處吸光度(A)值，篩選EGCG最佳濃度，以用于下步實驗。

表1 PCR的引物序列

1.3.2A549細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)細胞密度為5×108/L，等量接種于6孔板,隨機分為對照組(無血清DMEM-1640)與EGCG組(200 mg/L)，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集所有細胞，洗滌、重懸、計數(shù)并避光孵育30 min；Guava Easy Cyte Mini流式細胞儀檢測10 000個細胞紅色熒光和橙色熒光信號，實驗結(jié)果采用流式四象限散點圖表示，每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.3.3A549細胞內(nèi)iNOS蛋白的表達檢測 ①免疫組化分析iNOS蛋白的表達：將密度為5×108/L的A549細胞等量接種于含有多聚賴氨酸包被的小玻片的6孔板中，隨機分為對照組與EGCG組，細胞處理同上。培養(yǎng)24 h后用冷的40 g/L的多聚甲醛溶液室溫固定10 min, PBS洗3次，每次3 min，具體步驟根據(jù)PV-9000二步法說明書操作。以細胞內(nèi)呈現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)，隨機計數(shù)200個細胞，Image-pro Plus軟件分析陽性信號強度。②蛋白質(zhì)印跡定量分析iNOS蛋白的表達：同上密度的細胞接種于6孔板中，分組同上，24 h后收集A549細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取樣品蛋白，BAC法定量蛋白含量；制備SDS-PAGE膠，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(iNOS 1∶2 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 500)室溫孵育2h，顯色劑(1∶1)顯色，Lane 1D凝膠分析軟件分析，設(shè)未處理的細胞作為對照組，GAPDH作為內(nèi)參照。

1.3.4A549細胞內(nèi)iNOS mRNA表達檢測 以Trizol法提取細胞總RNA，取1 μL反應(yīng)體系，根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),并參照Takara Real Time-PCR說明書的步驟行PCR擴增,具體步驟如下：目的基因與內(nèi)參均為95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共35個循環(huán)。制定標(biāo)準曲線，根據(jù)標(biāo)準曲線公式計算樣本的拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EGCG對A549細胞增殖活性的影響

MTT法的檢測結(jié)果顯示，50、100、200 mg/L的EGCG對A549細胞均有抑制作用，其增殖活性分別為0.165±0.031、0.145±0.003、0.121±0.001，對照組為0.585±0.002，其中200 mg/L的EGCG組細胞增殖活性與其他組相比較差異有顯著意義(F=1 000.35，q=3.43～60.00,P<0.05)。200 mg/L的EGCG用于下一步實驗。

2.2 EGCG對A549細胞凋亡的影響

EGCG組晚期A549細胞凋亡率與對照組比較，差異有顯著性(χ2=65.23,P<0.05)。見圖1。

圖1 EGCG對A549細胞早晚期凋亡的影響

2.3 EGCG對A549細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和iNOS蛋白表達的影響

免疫細胞化學(xué)觀察結(jié)果顯示，與陰性對照(圖2A)相比，在無外界刺激時，A549細胞的胞質(zhì)和細胞核內(nèi)iNOS蛋白呈陽性表達(圖2B)。EGCG孵育后可見許多A549細胞形態(tài)改變，核固縮，有的細胞染色質(zhì)高度濃縮，呈聚集于核中央部的致密核，有的細胞染色質(zhì)呈花瓣狀或環(huán)狀(圖2C)；胞質(zhì)濃縮、細胞體積變小，脫落、聚集。EGCG可以降低貼壁生長的A549細胞中iNOS蛋白的表達水平(圖2C)，而固縮變小的A549細胞中iNOS蛋白表達增強，核碎裂時iNOS蛋白表達降低或呈陰性；對照組胞質(zhì)與胞核iNOS蛋白的表達量分別為153.6±2.1、70.7±1.6，EGCG組胞質(zhì)與胞核iNOS蛋白的表達量分別為90.6±1.0、60.7±1.9。與對照組比較，EGCG組A549細胞胞質(zhì)與胞核iNOS蛋白的表達量明顯降低，差異均有顯著意義(t=8.7、18.2，P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡定量分析顯示，對照組與EGCG組A549細胞iNOS蛋白的表達量分別為25.6±1.6、6.4±0.7，與對照組比較，EGCG組A549細胞中iNOS蛋白的表達量明顯降低，差異有顯著性(t=9.4,P<0.05)。見圖3。

2.4 EGCG對A549細胞iNOS mRNA表達影響

正常組與EGCG組A549細胞iNOS mRNA相對表達量分別為0.565±0.002、0.232±0.003，與對照組比較，EGCG組iNOS的mRNA相對表達量明顯下調(diào)，差異有顯著性(t=5.7,P<0.05)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡定量分析A549細胞中iNOS蛋白的表達量

3 討 論

NOS是體內(nèi)催化L-精氨酸生成NO的關(guān)鍵酶。目前已知的NOS分為4種類型：iNOS、神經(jīng)型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)，其中iNOS常在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及老化過程中被激活，激活后可在皮膚組織內(nèi)產(chǎn)生高水平的NO。NO是一種活性氣體小分子，可通過不同途徑介導(dǎo)組織損傷、細胞凋亡等病理過程[5]。有研究結(jié)果顯示，iNOS可導(dǎo)致心肌細胞損傷，其機制可能包括以下幾個方面：NO反應(yīng)生成超氧自由基，可誘導(dǎo)DNA損傷；NO可抑制線粒體呼吸，阻斷細胞內(nèi)能量合成及DNA的復(fù)制；NO能直接誘導(dǎo)細胞凋亡；NO作為氧自由基，調(diào)節(jié)p53基因，同時降低Bcl-2和上調(diào)Bax水平，促使Bcl-2/Bax比例失調(diào)，使之堆積并阻止細胞進入DNA合成期[6]。

茶多酚是從綠茶中提取出的多酚類化合物，兒茶素是茶多酚的主要成分。EGCG是茶多酚中含量最高，活性最強的單體[7-8]，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。本實驗結(jié)果顯示，在濃度為50～200 mg/L范圍內(nèi)，EGCG可明顯抑制人肺腺癌細胞A549的增殖，其濃度在200 mg/L時抑制作用更強。流式細胞儀檢測細胞結(jié)果顯示，EGCG可使處于早期和晚期凋亡的A549細胞百分率增加，晚期凋亡率增加更明顯，提示EGCG導(dǎo)致A549細胞不可逆性凋亡。免疫細胞化學(xué)法檢測結(jié)果顯示，A549細胞出現(xiàn)核固縮、胞質(zhì)濃縮、細胞體積變小等凋亡細胞的形態(tài)學(xué)特征；同時蛋白質(zhì)印跡定量分析和RealTime-PCR方法檢測結(jié)果一致，EGCG可抑制iNOS蛋白與mRNA的相對表達量。由此推測，EGCG可能通過抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡，下調(diào)iNOS蛋白與mRNA的相對表達量發(fā)揮抑癌作用。

[參考文獻]

[1] 劉超,張振華,耿燕. 去勢雄兔干眼癥模型淚腺組織NFκB p65亞基及NOS2表達[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2009,24 (1):43-45.

[2] VAKKALA M, KAHLOS K, I AKARI E, et al. Inducible nitric oxide synthase expression, apoptosis, and angiogenesis in situ and invasive breast carcinomas [J]. Clin Cancer Res, 2000,6(6):2408-2416.

[3] FELLEY-BOSCO E. Role of nitric oxide in genotoxicity:implication for carcinogenesis[J]. Cancer Metastasis Rev, 2008,17(1):25-37.

[4] SUN M H, HAN X C. Jiatric oxide synthase and matrix me-talloproteinase-9 and theireffects on angiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(38):5931-5937.

[5] ALBINA J E, CUI S, MATEO R B, et al. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macmphages[J]. Immunol, 1993,150(11):5080-5085.

[6] 沈衛(wèi),馬璇,劉琳,等. 藻藍蛋白對2型糖尿病大鼠心肌細胞內(nèi)iNOS表達影響[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2010,46(4):283-288.

[7] RAVINDRANATH M H, SARAVAUAN T S, MONTECLARO C C, et al. Epicatechins purified from green tea (camelliasinensis) diferentially suppress growth of gender-dependent human cancer cell lines[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2006,3(2):237-247.

[8] 楊彤濤,牛子長,李存孝,等. 表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯抑制骨肉瘤細胞增殖及其機制[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2007,23(10):1449-1451.