王海娟，李慧，王笑峰，王云，邢曉明，羅兵

(青島大學醫(yī)學院,山東 青島 266021 1 附屬醫(yī)院檢驗科; 2 微生物學教研室; 3 附屬醫(yī)院病理科)

鼻型結外NK/T細胞淋巴瘤(ENKTCL) 是2001年由WHO正式命名的一種非霍奇金淋巴瘤，該病具有獨特臨床表現以及細胞形態(tài)、免疫表型和遺傳學特征，是我國常見的非霍奇金淋巴瘤亞型之一[1-2]。ENKTCL的發(fā)生與EB病毒(EBV)感染密切相關，具有地域性，EBV感染是其致病因素還是伴隨現象，目前已成為ENKTCL病因學的研究熱點[1,3]。不同來源的EBV毒株在基因變異和生物學功能方面具有差異性，因此是否存在高致癌性的EBV變異毒株一直倍受關注。目前對ENKTCL中EBV基因型別的研究多集中于1/2分型，對F/f變異和C/D變異的研究較少[3]。LMP1 基因是公認的EBV惡性轉化基因，HU等[4]和CHEN等[5]在研究鼻咽癌時發(fā)現存在30 bp堿基缺失的LMP1基因，且缺失型LMP1與無30 bp堿基缺失的野生型比較具有更強的致瘤性和細胞轉化能力。有關鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤等腫瘤以及良性淋巴組織增生疾病中LMP1缺失型基因的情況已有報道，但結果不一[4-6]。本研究旨在檢測ENKTCL中EBV的感染情況，探討EBV陽性ENKTCL組織中病毒基因型以及LMP1編碼基因的變異情況，為進一步研究EBV感染與ENKTCL的關系提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

ENKTCL組織標本75例取自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2008年6月—2013年6月病理確診病例，其中男45例，女30例；病人年齡13～77歲，中位年齡50歲。發(fā)病部位主要為鼻腔、鼻咽等上呼吸道。實驗所用EBV陽性細胞系B95-8、Raji和EBV陰性Ramos細胞購自北京協和細胞資源中心，EBV陽性細胞系P3HR-1由日本鳥取大學醫(yī)學部生體情報學教室西連寺剛教授惠贈。

1.2 原位雜交篩選EBV陽性標本

按參考文獻方法[7]設計EBER1特異性寡核苷酸探針，Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling Kit標記探針購自Roche公司。石蠟包埋組織切片二甲苯脫蠟后乙醇梯度水化，用40 g/L甲醛溶液固定，蛋白酶K(100 mg/L)37 ℃消化15 min后，以1 g/L甘氨酸溶液輕洗30 s終止消化反應，加地高辛標記的EBER1寡核苷酸探針37 ℃雜交反應過夜。次日Blocking Buffer封片后加堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，37 ℃反應1 h，最后加顯色液(NBT/BCIP)置濕盒中37 ℃反應3 h，并用5 g/L甲基綠復染5～20 min。光鏡下觀察結果，細胞核濃染呈深紫色者為EBER1陽性。同步應用sense探針進行雜交反應特異性的檢測。

1.3 石蠟包埋腫瘤組織DNA提取

因腫瘤較小，部分病例不能取得足夠組織進行實驗，本研究切取56例原位雜交陽性ENKTCL石蠟包埋組織各5～8片，每片厚度約4 μm，采用德國QIAGEN公司QIAAmp FFPE DNA提取試劑盒提取DNA進行分型研究，操作嚴格按照試劑盒要求進行。

1.4 EBV 1/2分型、F/f分型及C/D分型檢測

依據基因缺失序列情況，參考文獻方法[8-9]設計引物，采用PCR技術檢測感染EBV的1/2分型，以PCR結合限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析技術檢測F/f分型以及C/D分型。

1.4.1PCR擴增 PCR反應體系為25 μL，包括DNA 模板3 μL，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 mmol/L，上下游引物各0.4 μmol/L。循環(huán)條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR擴增產物于含0.5 mg/L溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄結果。陽性對照的設置：細胞系B95-8作1型和F型對照；細胞系P3HR1為2型對照；細胞系Raji作為D型對照；本實驗室已成功鑒定的1例f型ENKTCL標本為f型陽性對照。每次PCR反應均用無酶雙蒸水作陰性對照。

1.4.2RFLP分析 采用德國QIAGEN公司凝膠DNA回收試劑盒對F/f分型、C/D分型的PCR產物進行回收，用BamH Ⅰ限制性內切酶消化。酶切體系15 μL，包括DNA 8 μL，10×K Buffer 1.5 μL，15×106U/L BamH Ⅰ 1 μL，無酶雙蒸水4.5 μL，充分混勻后瞬時離心，30 ℃水浴4 h。取酶切產物5 μL于含0.5 mg/L溴化乙錠的20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄結果。細胞系B95-8的EBV BamH Ⅰ F片段無BamH Ⅰ識別位點即為F型(酶切產物電泳條帶仍為198 bp)；f型對照標本在該區(qū)域出現BamH Ⅰ位點(PCR產物酶切后出現長127 bp和71 bp兩條帶)。細胞系Raji的 EBV BamH Ⅰ W1/I1交界區(qū)保留BamH Ⅰ識別位點為D型(PCR產物酶切后出現長130 bp和76 bp兩條帶)，酶切后仍呈單一條帶(206 bp)者為C型。

1.4.3基因序列分析 選取經酶切鑒定的F/f分型和C/D分型的4種EBV型別的部分標本，采用末端終止法、由北京華大基因有限公司對PCR擴增產物進行雙向測序，測序引物為PCR擴增引物。應用Primer premier 5軟件檢查序列有無BamH Ⅰ識別位點，對PCR-RFLP結果進行鑒定。

1.5 LMP1基因C端序列分析

參照文獻的方法[10]設計檢測LMP1基因C端30 bp缺失的特異性引物，采用PCR技術進行檢測，反應體系和擴增條件同上。同時選取部分標本的產物進行測序以驗證結果。

2 結 果

2.1 原位雜交

EBER1陽性信號位于腫瘤細胞的細胞核內，核濃染呈深紫色；毗鄰切片的同一組織蘇木精-伊紅染色顯示EBER1陽性信號均來源于腫瘤細胞。EBV陽性ENKCTL標本的組織切片用EBER1 sense探針雜交細胞核呈淺綠色，未出現陽性信號，證實了反應的特異性。本文75例ENKCTL標本中，共有67例EBER1陽性，陽性率為89.3%；發(fā)生在鼻腔部位的66例標本中有63例陽性，陽性率為95.0%。

2.2 EBV 1/2分型、F/f及C/D分型

1型EBV擴增條帶長為498 bp，2型EBV長為150 bp；C型EBV限制性核酸內切酶BamH Ⅰ酶切PCR產物后條帶長為206 bp，D型EBV酶切后表現為長130 bp和76 bp兩條帶；F型EBV限制性核酸內切酶BamH Ⅰ酶切PCR產物后條帶仍為長198 bp，f型EBV酶切后表現為長127 bp和71 bp兩條帶。見圖1。56例進行分型檢測的EBV陽性ENKTCL標本中，1型EBV 45例(80.4%)，2型EBV 11例(19.6%)；F型EBV 49例(87.5%)，f型EBV 7例(12.5%)；C型EBV 37例(66.1%)，D型EBV 19例(33.9%)。PCR產物測序結果證實F型EBV無BamH Ⅰ酶切位點，而由于突變f型EBV增加了BamH Ⅰ酶切位點；C型EBV無BamH Ⅰ酶切位點，D型EBV則保留了BamH Ⅰ酶切位點。

2.3 LMP1檢測

本文對48例EBV陽性ENKTCL標本LMP1的C端序列進行檢測分析，結果表明，野生型8例(16.7%)，缺失型40例(83.3%)。部分標本LMP1基因C端PCR產物電泳圖見圖2，161 bp者為野生型LMP1變異，131 bp者為缺失型LMP1變異。PCR產物經測序驗證結果可靠。

M:DNA Marker DL2000；④、⑦、、、、分別為1型、2型、F型、f型、C型、D型陽性對照；⑧、、為陰性對照；①～③為1型EBV標本；⑤、⑥為2型EBV標本,⑨～為F型EBV標本；、為f型EBV標本；～為C型EBV標本；為D型EBV標本。

圖1部分EBV陽性標本基因分型電泳結果

M:DNA Marker DL2000；①～④為LMP1野生型標本；⑤～⑦為LMP1缺失型標本；⑧為陰性對照。

3 討 論

ENKTCL在我國是一種較為常見的非霍奇金淋巴瘤，具有獨特的臨床病理特點，男性病人多于女性，年齡以40～50歲居多，好發(fā)于鼻腔[3]。EBV屬于皰疹病毒科γ亞科DNA腫瘤病毒，90%以上的健康成人攜帶該病毒，雖然大部分EBV感染者一直處于隱性感染狀態(tài)，但EBV感染可促使相關腫瘤的

產生。EBV感染與人類多種淋巴細胞和上皮性腫瘤的發(fā)生有關，例如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等，早在1997年的世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)的報告中，已經將EBV歸類為致癌病毒[11-13]。在本研究中EBER1 原位雜交陽性率高達89.3%(56/75)，提示EBV感染與ENKTCL的發(fā)生密切相關，尤其是發(fā)生在鼻腔部位的病例，EBV感染率高達95.0%，而鼻外器官EBV感染率則相對較低，說明EBV感染有部位依賴性，可能是在鼻咽及口腔部位病理損傷的基礎上，EBV于鼻咽部和口腔腺體上皮細胞中的長期潛伏誘發(fā)了ENKTCL[3]。

ENKTCL好發(fā)于亞洲及拉丁美洲等地區(qū)，這與EBV慢性感染者的地理分布相吻合，而且不同地區(qū)人群感染的EBV基因類型也不相同[3,14-15]。目前，對ENKTCL中EBV基因型別的研究多集中于1/2分型，而對F/f變異和C/D變異的研究較少[3]。本研究顯示，本地區(qū)EBV感染以1型為主，與先前亞洲地區(qū)的報道結果相符[16-17]。有研究顯示，1型與2型EBV的生物學功能存在差異，1型EBV的B細胞轉化功能更強。本文結果提示，本地區(qū)ENKTCL的發(fā)生與細胞轉化功能更強的1型EBV感染密切相關。而有關研究顯示，在秘魯及巴西ENKTCL病人中2型EBV感染占主導地位[3,14]。由此進一步說明不同EBV基因型在不同地區(qū)的分布不同。

本文結果顯示，本地區(qū)ENKTCL病人EBV以F(87.5%)及C(66.1%)型變異較為多見，與本地區(qū)鼻咽癌組織中EBV的基因類型相符[18]。SIDAGIS等[19]報道，日本EBV相關T/NK淋巴細胞瘤組織中C型和F型變異率較高，分別為72.7% (8/11)和100% (11/11)，且F型和C型EBV也是EBV相關胃癌和鼻咽癌的主要毒株；而在歐洲和北美地區(qū)鼻咽癌組織中則以D型及f型EBV毒株為主[20]。由此可見，不同地區(qū)感染EBV基因類型有所不同，本地區(qū)EBV陽性ENKTCL組織中感染的EBV以1型、F型和C型為主，而不同類型EBV基因變異對ENKTCL發(fā)生發(fā)展的影響有待進一步研究。

作為公認的EBV轉化基因和致癌基因，LMP1能誘導Bcl-2 基因產物表達，阻止細胞凋亡，從而使EBV感染細胞永生化，還可在體外轉化哺乳動物纖維母細胞和人角質細胞，抑制人上皮細胞的分化和凋亡，誘導表皮生長因子受體的表達，促進腫瘤的轉移，且在大多數EBV相關腫瘤組織中表達，在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用[21]。而且有關鼻咽癌的研究結果顯示，LMP1缺失型與野生型比較致瘤性和細胞轉化能力更強[4-5]。在國內尚未有ENKTCL組織中LMP1缺失型與野生型的詳盡報道。本研究結果顯示，在ENKTCL中感染的EBV以LMP1缺失型為主，提示LMP1編碼基因C端30 bp堿基的缺失可能與ENTKCL的發(fā)生有一定相關性。有研究認為，這種缺失型的致瘤性和細胞轉化能力明顯增強，且免疫原性減弱，可能是因為LMP1基因的30 bp堿基缺失處正位于NF-κB 的上游，在形成淋巴瘤后缺失型LMP1被激活, 促使NF-κB異常活化, 從而產生抗凋亡性; 也可能是由于部分遺傳結構的丟失減弱了LMP1蛋白的免疫原性, 使之較易逃避機體的免疫監(jiān)視, 最終延長并增強了LMP1的致瘤作用[6]。LMP1缺失型在ENKTCL發(fā)生中的致瘤作用尚未明確，本研究擬進一步擴大樣本量, 在蛋白水平上直接檢測LMP1野生型和缺失型基因的表達情況, 深入探討LMP1野生型和缺失型在ENKTCL發(fā)生中的意義。

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