潘 越， 馮志勇， 陳 輝， 陳明杰， 汪 虹， 張津京

(1. 國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095)

顏色幾乎是自然界所有生物的重要表觀特征之一。人們對(duì)顏色的研究起源已久，黑色素是影響生物顏色的主要因素之一。黑色素代謝對(duì)生物的生長(zhǎng)至關(guān)重要，黑色素代謝異常就可能會(huì)導(dǎo)致白化個(gè)體的出現(xiàn)。白化個(gè)體形成的主要原因是這些個(gè)體缺失了與黑色素合成相關(guān)的基因或這些基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致黑色素的合成受到阻礙[1]。例如，在真菌領(lǐng)域中，桑紅等人對(duì)白化新生隱球菌進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)新生隱球菌白化突變是由于漆酶基因部分序列的缺失導(dǎo)致的[2]。

關(guān)于黑色素代謝異常與白化菌株形成的關(guān)系在真菌中已有研究，鄢洪海等人通過(guò)對(duì)玉米彎孢葉斑病菌白化菌株與黑色菌株的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，白化菌株的致病性明顯減弱，而該病菌產(chǎn)生的黑色素是一個(gè)與致病性相關(guān)的重要因子，因此認(rèn)為白化菌株的形成與黑色素的代謝異常具有密切關(guān)系[3]。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有研究白色食用菌的報(bào)道，如白色金針菇，白色側(cè)耳，白色真姬菇等等[4-6]。白色食用菌具有鮮美獨(dú)特的口味，因此深受消費(fèi)者的青睞。但是白色食用菌菌株普遍表現(xiàn)出生長(zhǎng)能力變?nèi)酰瑢?duì)營(yíng)養(yǎng)條件和環(huán)境條件要求較高，抗逆能力變差等現(xiàn)象[7]，因此白色食用菌的形成機(jī)理亟待研究。目前的研究認(rèn)為，食用菌白化菌株的形成主要是由于食用菌中黑色素的代謝異常導(dǎo)致的，黑色素合成相關(guān)酶的異常代謝則是最主要的因素。鑒于此，本文對(duì)近年來(lái)食用菌黑色素代謝的相關(guān)研究進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述，以期為食用菌白化菌株形成機(jī)理的研究提供參考。

1 食用菌黑色素合成途徑

食用菌中黑色素的合成途徑主要有兩種：L-dopa途徑和DHN途徑(圖1)[8, 9]。

1.1 L-dopa途徑

L-dopa途徑與哺乳動(dòng)物中黑色素的合成途徑較為相似，該途徑中存在兩種前體物質(zhì)——L-dopa(左旋多巴)和酪氨酸。它們分別在漆酶和酪氨酸酶的催化作用下形成多巴醌，多巴醌氧化成多巴色素后再通過(guò)構(gòu)像變化形成二羥吲哚，二羥吲哚在聚合作用下最終形成黑色素[10]。

1.2 DHN途徑

在DHN途徑中，首先由小分子前體物質(zhì)乙酰coA和丙二酰coA在聚酮合成酶的催化下形成1, 3, 6, 8-四羥基萘(1, 3, 6, 8-THN)，在一系列氧化還原反應(yīng)的作用下，形成小柱孢酮、柱孢醌和1, 3, 8-三羥基萘等中間體，最終形成1, 8-二羥基萘(DHN)，DHN在酚氧化酶的氧化聚合作用下即可形成黑色素[11]。

圖A為L(zhǎng)-dopa途徑；圖B為DHN途徑。

圖1食用菌黑色素合成的兩種代謝途徑
Fig 1 Comparison of L-dopa (A) and DNH (B) melanin synthesis pathways
(引自Helene C 2012)

2 食用菌黑色素合成相關(guān)的酶

2.1 L-dopa途徑中的關(guān)鍵酶

2.1.1 酪氨酸酶

酪氨酸酶(Tyrosinase)是一種含銅糖蛋白，一般也稱(chēng)為多酚氧化酶，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶[12]。它主要在L-dopa途徑中發(fā)揮作用，催化酪氨酸羥化而啟動(dòng)一系列生化反應(yīng)，在此過(guò)程中，酪氨酸酶主要參與兩個(gè)反應(yīng)過(guò)程：催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌。多巴醌再經(jīng)一系列反應(yīng)后，最終生成黑色素[13]。如果酪氨酸酶受到抑制，黑色素的合成就會(huì)受到影響。在食用菌中，雙孢蘑菇的酪氨酸酶較早受到關(guān)注，20世紀(jì)70年代，Turner等人就提出酪氨酸酶可能在雙孢蘑菇黑色素的合成中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用[14]。Wangsa 等人進(jìn)一步研究了雙孢蘑菇中酪氨酸酶的晶體結(jié)構(gòu)，這對(duì)食用菌黑色素合成機(jī)制的研究具有重要的指導(dǎo)作用[15]。

食用菌白化菌株的形成可能是由于黑色素合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的表達(dá)受到抑制，因此對(duì)這些酶的抑制劑的研究尤為重要。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)酪氨酸酶抑制劑的研究層出不窮，黑色素是酚類(lèi)化合物的聚合物，有研究表明，單酚基化合物對(duì)食用菌中酪氨酸酶的活性有明顯的影響[16]。近年來(lái)，隨著對(duì)酪氨酸酶研究的深入，越來(lái)越多的酪氨酸酶抑制劑受到研究者的關(guān)注， Jin Hee KIM等人從紫云英提取物中分離到一種酪氨酸酶天然抑制劑——毛蕊異黃酮，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該物質(zhì)對(duì)食用菌中酪氨酸酶的抑制作用非常顯著，且該物質(zhì)沒(méi)有任何毒性，對(duì)食用菌的生長(zhǎng)沒(méi)有任何影響[17]。Anan 等人在對(duì)寡肽類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩種寡肽序列可以影響食用菌酪氨酸酶的活性，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用抑制酪氨酸酶的表達(dá)[18]。Danielle等人通過(guò)對(duì)白藜蘆醇類(lèi)似物的研究認(rèn)為，多種白藜蘆醇類(lèi)似物可以對(duì)食用菌酪氨酸酶有顯著的抑制作用，并指出這類(lèi)物質(zhì)主要是通過(guò)酚醛環(huán)第4位碳上的羥基化來(lái)發(fā)揮其抑制作用的[19]。另外，含間苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物大多是酪氨酸酶的抑制劑，當(dāng)對(duì)位存在取代基時(shí)，這類(lèi)化合物具有很強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，它們可以與酪氨酸酶的雙銅離子活性中心結(jié)合，因此可以對(duì)酪氨酸酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[19]。

2.1.2 漆酶

漆酶(Laccase)是一類(lèi)性質(zhì)相近又不完全相同的多酚氧化酶的總稱(chēng)，它是一種含銅的多酚氧化酶[20， 21]。漆酶具有廣泛的底物作用范圍，可以氧化降解包括單酚、鄰苯二酚等多種酚類(lèi)化合物及其衍生物，也可以氧化降解一些不含酚羥基的酚類(lèi)類(lèi)似物[22]。由于黑色素的合成過(guò)程涉及到多種酚類(lèi)化合物，因此漆酶在黑色素的合成過(guò)程中具有重要的作用。在銅離子存在的情況下，漆酶可以催化L-dopa途徑中黑色素的合成，將L-3, 4-二羥苯丙氨酸氧化成為多巴醌，再進(jìn)一步合成黑色素[23]。Masaru等人報(bào)道了香菇中漆酶與黑色素合成的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)漆酶活性與香菇菌褶褐化的程度成正相關(guān)，因此認(rèn)為漆酶在香菇黑色素合成過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用[24]。Yuko等人使用香菇的兩種不同功能的漆酶建立了一種嵌合體漆酶，認(rèn)為香菇的一種漆酶——Lcc4在黑色素合成中發(fā)揮作用，且Lcc4的N末端為活性部位[25]。

漆酶如果受到抑制，黑色素的合成就會(huì)受到影響。因?yàn)槠崦甘且环N含銅蛋白質(zhì)，因此某些銅的鰲合劑如氰化物、疊氮化物和EDTA等均可阻礙漆酶催化功能的發(fā)揮。曲酸是公認(rèn)的漆酶抑制劑，Giuseppe Battaini等人在對(duì)曲酸進(jìn)行研究時(shí)認(rèn)為，曲酸對(duì)包括漆酶在內(nèi)的多數(shù)多酚氧化酶均具有抑制作用[26]。由于曲酸的這種對(duì)黑色素合成的抑制作用，它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于美白及脫色工業(yè)之中[27]。

2.2 DHN途徑中的關(guān)鍵酶——聚酮合成酶

聚酮合成酶(Polyketide Synthases)是一類(lèi)復(fù)雜的多酶體系，多以脂酰CoA 為底物，通過(guò)重復(fù)的脫羧縮合過(guò)程產(chǎn)生線(xiàn)性聚酮化合物或環(huán)狀的酮內(nèi)酯[28]。有研究認(rèn)為在DHN合成途徑中，一種聚酮合成酶在此途徑中發(fā)揮重要作用，它可以催化1, 3, 6, 8-四羥基萘的合成，然后再經(jīng)過(guò)一系列的氧化還原反應(yīng)最終生成黑色素[29]。Tang等人在研究香菇褐化機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)，聚酮合成酶在與O-甲基轉(zhuǎn)移酶、P450-單氧化酶及漆酶的共同作用下參與了香菇的褐化反應(yīng)，因此認(rèn)為聚酮合成酶在香菇黑色素合成中發(fā)揮了一定的作用[30]。

聚酮合成酶基因缺失或者表達(dá)受到抑制時(shí)，黑色素的合成就會(huì)受到影響。張?chǎng)蔚热送ㄟ^(guò)RNA干擾技術(shù)獲得了聚酮合成酶基因沉默的轉(zhuǎn)化子，發(fā)現(xiàn)聚酮合成酶表達(dá)量減少的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)黑色素的能力明顯降低，菌落顏色變淺，驗(yàn)證了聚酮合成酶在黑色素合成中的重要作用[31]。

3 食用菌黑色素合成的其他影響因素

除了黑色素合成途徑中各種關(guān)鍵酶的作用，外部環(huán)境對(duì)黑色素的代謝也存在不可忽視的影響。有研究報(bào)道，由于黑色素較為穩(wěn)定，且由于它的疏水性，它在大多數(shù)溶劑中都不可被溶解，因此不易降解[32]。pH值對(duì)黑色素的合成具有重大的影響，F(xiàn)rancisco等研究了不同pH值條件下黑色素合成的情況，結(jié)果顯示，在不同的pH值下，黑色素合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的產(chǎn)物[33]。另一方面，黑色素可以溶解于堿性溶劑，因此在堿性的條件下黑色素有可能被破壞。另外由于黑色素合成過(guò)程中的多種酶為銅離子依賴(lài)酶，所以銅離子的存在對(duì)黑色素的形成也有至關(guān)重要的影響[8]。

4 展望

隨著中國(guó)食用菌產(chǎn)量的不斷增長(zhǎng)，人們對(duì)食用菌產(chǎn)品品質(zhì)的要求也不斷提高，白色食用菌以其獨(dú)特的外觀和口感，更為消費(fèi)者所喜愛(ài)，故白色食用菌品種更具市場(chǎng)價(jià)值。而食用菌中黑色素代謝與白色食用菌的形成密切相關(guān)，因此，對(duì)食用菌黑色素代謝進(jìn)行深入研究，找到該代謝途徑的關(guān)鍵基因，并揭示其作用機(jī)理，對(duì)于白色食用菌品種的開(kāi)發(fā)具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)食用菌黑色素代謝的研究鮮有報(bào)道，相關(guān)研究開(kāi)展較少，相信隨著國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)食用菌黑色素代謝及食用菌白化菌株研究的不斷深入，必定能揭示白色食用菌的形成機(jī)理，推動(dòng)食用菌白色品種的開(kāi)發(fā)進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)：

[1]Haiaban R, Svedine S, Chen E, et al. Endoplasmie reticulum letention is a common defect associated with tyrosinase-negative albinism[J]. Proc Naitl Sci USA, 2000, 97(11):5889-5894.

[2]桑 紅，廖萬(wàn)清，陳 江，等．新生隱球菌白化株酚氧化酶結(jié)構(gòu)基因的突變研究[J]．中國(guó)皮膚科雜志，2004, 34(5):333-335.

[3]鄢洪海，陳 捷，夏淑春，等．玉米彎孢葉斑病菌白化菌株初報(bào)[J]．菌物系統(tǒng)，2002, 21(4):604-606.

[4]劉維俠. 金針菇色澤基因的分子標(biāo)記技術(shù)研究[D]．福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2004.

[5]盛春鴿，黃成陽(yáng)，陳 強(qiáng)，等．白黃側(cè)耳子實(shí)體顏色遺傳規(guī)律[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012, 45(15):3124-3129.

[6]許占伍. 真姬菇子實(shí)體顏色初探及單核體多態(tài)性分析[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[7]蟻瑞榮. 淺黃色金針菇子實(shí)體顏色表達(dá)的初探[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[8]Helene C. Synthesis and assembly of fungal melanin[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93:931-940.

[9]Rafael R, Michael W, Antonieta G, et al. Biosynthesis and functions of melanin inSporothrixschenckii[J]. Infection and Immunity, 2000, 68(6):3696-3703.

[10]Land E J, Ramsden C A, Riley P A. Quinone chemistry and melanogenesis[J]. Methods Enzymol, 2004, 378:88-109.

[11]侯幼紅，呂江陵，黃 瑛，等．真菌色素與真菌感染[J]．中國(guó)真菌學(xué)雜志，2008, 3(6):375-380.

[12]Hearing V J, Jimenez M. Analysis of mammalian pigmentation at the molecular level[J]. Pigment Cell Res, 1989, 2(2): 75-85.

[13]陳清西，宋康康．酪氨酸酶的研究進(jìn)展[J]．廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006, 45(5):731-737.

[14]Turner E M. Phenoloxidase activity in relation to substrate and development stage in the mushroom,Agaricusbisporus[J]. Trans Brit Mycol Soc, 1974, 63:541-547.

[15]Wangsa T I, Henriette J R, Marloes S, et al. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of tyrosinase from the mushroomAgaricusbisporus[J]. Structural Biology and Crystallization Communications, 2011, 67:575-578.

[16]陳清西，宋康康．酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]．廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007, 46(2):274-282.

[17]Kim J H, Kim M R, Lee E S, et al. Inhibitory effects of calycosin isolated from the root ofAstragalusmembranaceuson melanin biosynthesis[J]. Biol Pharm Bull, 2009, 32(2):264-268.

[18]Anan A U, Zhao L M, Wang Y, et al. Short-sequence oligopeptides with inhibitory activity against mushroom and human tyrosinase[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2009, 129:2242-2249.

[18]Danielle C Z F, Gustavo S G C, Paula R R, et al. Inhibitory effects of resveratrol analogs on mushroom tyrosinase activity [J]. Molecules, 2012, 17:11816-11825.

[19]Chen Q X, Song K K, Qiu L, et al. Inhibitory effects on mushroom tyrosinase by p-alkoxybenzoic acids [J]. Food Chemistry, 2005, 91:269-274.

[20]Miao L, Zhang G Q,Wang H X, et al. Purification and characterization of a laccase from the edible wild mushroomTricholomamongolicum[J]. Microbiol Biotechnol, 2010, 20 (7):1069-1076.

[21]許 穎，蘭 進(jìn)．真菌漆酶研究進(jìn)展[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2005, 12(1):57-64.

[22]鈔亞鵬，錢(qián)世鈞．真菌漆酶及其應(yīng)用[J]．生物工程進(jìn)展，2001, 21(5):23-28.

[23]Williamson P R. Laccase and melanin in the pathogenesis ofCryptococcusneoformans[J]. Front Biosci, 1997, 2:e99-e107.

[24]Masaru N, Maki K, Hisayuki W, et al. Important role of fungal intracellular laccase for melanin synthesis: purification and characterization of an intracellular laccase fromLentinulaedodesfruit bodies[J]. Microbiology, 2003, 149:2455-2462.

[25]Yuko N, Yuichi S, Sayaka K, et al. A chimeric laccase with hybrid properties of the parentalLentinulaedodeslaccases[J]. Microbiological Research, 2010, 165:392-401.

[26]Giuseppe B, Enrico M, Luigi C, et al. Inhibition of the catecholase activity of biomimetic dinuclear copper complexes by kojic acid [J]. JBIC, 2000, 5 : 262-268.

[27]Fujimoto N, Watanabe H, Nakatani T, et al. Induction of thyroid tumours in (C57BL/6N x C3H/N)F1 mice by oral administration of kojic acid[J]. Food Chem Toxicol, 1998, 36:697-703

[28]楊凱睿，高向東，顧覺(jué)奮．聚酮合成酶應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2012, 33(3):99-103.

[29]Langfelder K, Streibel M, Jahn B, et al. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi[J]. Fungal Genet Biol, 2003, 38:143-158.

[30]Tang L H, Jian H H, Song C Y, et al. Transcriptome analysis of candidate genes and signaling pathways associated with light-induced brown film formation inLentinulaedodes[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97:4977-4989.

[31]張 鑫，曹志艷，劉士偉，等．玉米大斑病菌聚酮體合成酶基因StPKS 功能分析[J]．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011, 4(8):1603-1609.

[32]Nosanchuk J D, Casadevall A. The contribution of melanin to microbial pathogenesis[J]. Cell Microbiol, 2003, 5:203-223.

[33]Francisco G C, Francisco G C, Juan V S, et al. The role of pH in the melanin biosynthesis pathway[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1982, 257(15):8738-8744.