侯士昌， 崔玉琳， 溫少紅， 唐志紅， 秦 松

(1. 煙臺大學 生命科學學院, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003)

亞心型扁藻(Platymonussubcordiformis) 是一種海洋產(chǎn)的單細胞浮游藻類，屬衣藻科、扁藻屬。亞心型扁藻因具有適應能力強，繁殖速度快，適口性好，必需氨基酸含量高及自身能夠合成并富集高濃度多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)[1]等特點，是生產(chǎn)中人們廣泛采用的優(yōu)良海產(chǎn)餌料[2]，在水產(chǎn)經(jīng)濟動物育苗中廣為應用。此外，亞心型扁藻在藥用研究[3]、化合物毒性評估[4]及光合放氫[5]等方面同樣具有廣闊的開發(fā)空間。

psbA基因是光合作物葉綠體基因組中的一個重要光調(diào)控基因，編碼光系統(tǒng)Ⅱ反應中心的核心蛋白D1，介導光合作用中的電子傳遞。psbA基因在不同的光合作物之間具有高度的同源性[6]。到目前為止，psbA基因在植物(如水稻、小麥、煙草、菠菜等)[7]和藻類(如岡村枝管藻[8]、小球藻[9]等)里都有報道研究，但是在亞心型扁藻里卻鮮有報道。本文以亞心型扁藻為材料，采用基因步移的手段克隆了葉綠體基因psbA并對其序列進行了分析，以期為亞心型扁藻的分子生物學研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

亞心型扁藻藻株為中國科學院煙臺海岸帶研究所保存與培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 藻體的培養(yǎng)與收集

亞心型扁藻采用f/2培養(yǎng)基，光照強度80～90 μmolm-2s-1，于23℃以12 h/12 h的光暗周期進行靜止培養(yǎng)。10 d左右以6000 r/min離心5 min收集藻體，備用。

1.2.2 總DNA的提取

DNA提取依據(jù)CTAB法進行。取100 mg樣品置于1.5 mL的離心管中，液氮冷卻10 min，充分研磨后加入900 μL CTAB，震蕩混勻后加入35 μL β-巰基乙醇，65℃溫浴1 h；加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻后12000 r/min離心15 min，取出上清液，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，重復2次；向上清液中加入0.8倍體積異丙醇，-20℃放置3 h，12000 r/min離心15 min，棄上清；用70%乙醇洗滌DNA沉淀2次，晾干，將DNA溶解于30 μL的TE緩沖液中，加入3 μL RNase于37℃處理0.5 h，電泳檢測。

1.2.3psbA基因的克隆和分析

根據(jù)GenBank上收錄的萊茵衣藻psbA基因序列(基因登錄號：HQ667991.1)，人工設計合成6段寡聚核苷酸片段作為引物，結(jié)果如表1。以提取的亞心型扁藻總DNA為模板，配合Takara公司基因步移試劑盒里的兼并引物AP1，分別對亞心型扁藻葉綠體基因psbA的5′端和3′端進行SP1、SP2及SP3步移PCR反應。

表1亞心型扁藻psbA基因步移反應設計引物

PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，目的片段DNA用Takara公司膠回收試劑盒進行回收與純化，利用pMD-18T載體進行體外重組，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌體內(nèi)。對挑取的單克隆進行測序，然后對該序列用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST進行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA的提取

對提取的基因組DNA用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1。獲得的基因組DNA條帶明亮且比較集中，說明提取的基因組DNA濃度高、純度好，可用于PCR實驗。

M—DNA分子質(zhì)量標準；1、2—基因組DNA。

2.2 PCR產(chǎn)物的分析

以提取到的基因組DNA為模板，分別從5′端和3′端進行SP1、SP2及SP3步移PCR，結(jié)果如圖2和圖3。回收目的片段后進行DNA拼接和測序，結(jié)果如圖4。在所測序列中，psbA基因全長1939 bp，編碼區(qū)片段大小為1066 bp，為單外顯子基因，編碼353個氨基酸；5′端非翻譯區(qū)片段長429 bp，轉(zhuǎn)錄起始位點位于翻譯起始密碼子ATG上游第108個核苷酸G；3′端非翻譯區(qū)片段長444 bp，具有多個多聚A和多聚T以及短的回文結(jié)構(gòu)。此外，編碼區(qū)T、C、A、G的平均含量分別為36%、20%、25%及19%；其中，A+T的含量為61%，明顯高于G+C的含量，表現(xiàn)出很強的堿基(A+T)組成偏向性。

M—DNA分子質(zhì)量標準；1、2—SP3 PCR步移結(jié)果。

M—DNA分子質(zhì)量標準；1—SP3 PCR步移結(jié)果。

圖4 亞心型扁藻psbA基因編碼區(qū)序列

葉綠體的基因組序列高度保守。psbA基因編碼區(qū)的核苷酸序列同源性在雙子葉植物之間超過90%，其編碼的氨基酸序列在大豆、煙草、水稻等植物之間的保守性超過98%。在藻類等低等植物之間，psbA的同源性在84%～90%[10]之間。對得到的基因片段與萊茵衣藻psbA序列(基因登錄號：HQ667991.1)進行比對，核苷酸序列同源性達到87.92%，翻譯成的氨基酸序列相似性為91.79%。這一方面說明采用PCR步移擴增成功得到亞心型扁藻psbA基因(基因登錄號：KF528742)，另一方面，psbA基因在亞心型扁藻體內(nèi)是比較保守的，這可能與D1蛋白的電子傳遞功能有關(guān)[9]。

此外，鐘珍萍等[10]研究發(fā)現(xiàn)光合植物葉綠體psbA基因內(nèi)沒有或很少編碼賴氨酸殘基的密碼子，特別是在陸生植物體內(nèi)。藻類中，纖細裸藻有5個密碼子，魚腥藻有2個密碼子，萊茵衣藻無此密碼子，但是在推導的亞心型扁藻所編碼的氨基酸中含有4個賴氨酸殘基。

目前利用L-賴氨酸為配基制作的HyperD親和層析填料含有一個較長的間隔鍵，使得該填料更容易結(jié)合賴氨酸配基，具有穩(wěn)定性高、親和力強的特點，可以快速高效地純化含有賴氨酸的蛋白質(zhì)，這或許為亞心型扁藻光合蛋白D1的分離純化提供了有效地方法。

2.3 有效密碼子數(shù)和密碼子第3位堿基中G+C含量分析

有效密碼子數(shù)(Effective number of codons，ENC)代表著某一基因中各同義密碼子之間偏好使用的程度，可以為密碼子的使用偏好性提供客觀的判斷[11]。ENC值的范圍從20到61之間，分別表示著某一個氨基酸只使用一個密碼子和平均使用各個密碼子的兩種極端情況，與20越接近則偏好性越強。密碼子第3位堿基中G+C含量(GC3s)表示G+C的含量與第3位堿基總量的比值。

應用在線程序EMBOSS[12]計算亞心型扁藻葉綠體基因psbA的ENC值和GC3s值分別為39.871和0.3183，ENC值偏小，表明亞心型扁藻psbA基因具有明顯的密碼子使用偏好性；亞心型扁藻psbA基因編碼區(qū)G+C含量低，而GC3s值更低，說明psbA基因偏好使用以A、T結(jié)尾的密碼子。鐘珍萍等[10]通過對葉綠體基因psbA的表達調(diào)控研究認為，在光合植物體內(nèi)psbA基因?qū)NC的選擇優(yōu)于NNT，這與亞心型扁藻葉綠體基因psbA的表達不一致。

2.4 密碼子偏好性分析

相對同義密碼子使用度(Relative synonymous codon usage，RSCU)可以直觀地反應密碼子使用的偏好程度，指在編碼特定氨基酸的密碼子中，某一密碼子在同義密碼子中使用的相對概率[13]。RSCU值等于1表示密碼子沒有使用偏好，大于1則表明密碼子的使用偏好性較強，反之亦然。比例(Fraction)表示在編碼該氨基酸的密碼子中某一密碼子所占的比例，所有比例相加總和是1。頻率(Frequency)代表某一密碼子在1000個基因編碼總密碼子中出現(xiàn)的次數(shù)。

表2 EMBOSS和CodonW 程序分析亞心型扁藻psbA基因的密碼子偏好性

續(xù)表2 Table 2(continued)

(f/‰)TTTF0.42330.986110.85GGAG0.0775.63420.31GGCG0.0775.63420.31GGGG0.0775.63420.31GGTG0.76956.338203.08CACH0.71414.08551.43CATH0.2865.63420.57ATAI0.0715.63420.21ATCI0.57145.070161.71ATTI0.35728.169101.07AAAK1.00011.26842.00AAGK0.0000.00000.00CTAL0.0000.00000.00CTCL0.0615.63420.36CTGL0.0000.00000.00CTTL0.24222.53581.45TTAL0.60656.338203.64TTGL0.0918.45130.55ATGM1.00030.986111.00AACN0.56225.35291.12AATN0.43819.71870.88CCAP0.47122.53581.88CCCP0.0592.81710.24CCGP0.0592.81710.24CCTP0.41219.71871.65CAAQ0.90928.169101.82CAGQ0.0912.81710.18AGAR0.26314.08551.58AGGR0.1588.45130.95CGAR0.0532.81710.32CGCR0.1055.63420.63CGGR0.0532.81710.32CGTR0.36819.71872.21AGCS0.10811.26840.65AGTS0.13514.08550.81TCAS0.29730.986111.78TCCS0.0272.81710.16TCGS0.10811.26840.65TCTS0.32433.803121.95ACAT0.26711.26841.07ACCT0.0000.00000.00ACGT0.0672.81710.27ACTT0.66728.169102.67GTAV0.47425.35291.89GTCV0.0000.00000.00GTGV0.0532.81710.21GTTV0.47425.35291.89TGGW1.00025.35291.00TACY0.52925.35291.06TATY0.47122.53580.94TAG?1.00014.0851?TAA?0.0000.0000?TGA?0.0000.0000?

*—代表終止密碼子。

CodonW在線程序[12]計算結(jié)果如表5，亞心型扁藻psbA基因密碼子中，25個密碼子的RSCU值大于l，具有一定的偏好性(表2以下劃線標出)。其中，GCA、GCT、TCT、GAT、GAA、GGT、ATT、AAA、CTT、TTA、CCT、CAA、AGA、CGT、TCA、TCT、ACA、ACT、GTA及GTT共20個密碼子是以A或T堿基結(jié)尾的，且Fraction值也較大，為亞心型扁藻psbA基因的偏好密碼子。大多數(shù)C或G堿基結(jié)尾的密碼子的RSCU值較低，表明這些密碼子在該基因中的使用次數(shù)較少；其終止密碼子使用了TAG。

3 結(jié)論

psbA基因的核苷酸序列具有高度保守性，國內(nèi)外很多研究者利用這一特性直接從基因組中擴增出psbA基因。本實驗利用PCR步移法從亞心型扁藻(Platymonassubcordiformis)基因組DNA中克隆得到psbA基因，獲得的psbA核苷酸序列與衣藻中該基因序列的同源性達到87.92%，二者編碼的氨基酸殘基同源性高達91.79%。

密碼子的使用偏好性是在進化過程中內(nèi)外因素的綜合作用下演變來的，不同物種體內(nèi)密碼子的偏好性不同，特定氨基酸對同義密碼子的選擇也不一樣[14]。亞心型扁藻葉綠體基因psbA的ENC值和GC3s值都較低，表明psbA基因具有明顯的密碼子偏好性，偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子；RSCU值顯示25個psbA的偏好密碼子中有20個是以A或T堿基結(jié)尾的，同樣，psbA基因的堿基組成分析顯示psbA基因表現(xiàn)出很強的堿基(A+T)組成偏向性。另外，亞心型扁藻psbA基因偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子，與之前報道的光合植物體內(nèi)psbA基因?qū)NC的選擇優(yōu)于NNT不一致[10]。亞心型扁藻的這種特征可能和它是一種低等的藻類有關(guān)，生長過程中容易受到各種影響而表現(xiàn)在對密碼子的選擇偏好性上。目前課題組正在克隆亞心型扁藻葉綠體的其余基因，以期為亞心型扁藻葉綠體基因的深入探究提供理論支持。

到目前為止，psbA基因在多種植物和藻類中都有研究，但是在亞心型扁藻里卻鮮有報道。本文克隆得到亞心型扁藻葉綠體基因psbA序列，一方面為研究藻類psbA基因的特點及編碼序列提供理論依據(jù)，另一方面為實現(xiàn)不同藻類之間甚至藻類和高等植物之間的葉綠體基因工程提供序列重組的參考。

參考文獻:

[1]韓立中, 曾慶波, 孫 麗, 等. 亞心型扁藻培養(yǎng)技術(shù)要點[J]. 天津水產(chǎn), 2006(04): 40-22.

[2]張華軍, 李元廣, 魏曉東, 等. 亞心形扁藻培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化[J]. 海洋科學, 2003, 27(5): 37-41.

[3]劉 艷, 楊海波, 于 媛, 等. 扁藻多糖的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征的研究[J]. 生物學雜志, 2007, 24(3): 29-31.

[4]李 坤, 李 琳, 侯和勝, 等. Cu2+, Cd2+, Zn2+對兩種單胞藻的毒害作用[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2002, 8(4): 395-398.

[5]Guan Y F, Deng M C, Yu X J, et al. Two-stage photo-biological production of hydrogen by marine green algaePlatymonassubcordiformis[J]. Biochemical Engineering Journal, 2004, 19(1): 69-73.

[6]Hirose T, Sugiura M. Cis-acting elements and trans-acting factors for accurate translation of chloroplastpsbAmRNAs: development of an in vitro translation system fromTobaccochloroplasts[J]. The EMBO Journal, 1996, 15(7): 1687.

[7]晁岳恩, 吳政卿, 楊會民, 等. 11種植物psbA基因的密碼子偏好性及聚類分析[J]. 核農(nóng)學報, 2011, 25(5): 927-932.

[8]朱清華, 張學成, 李玉暉. 岡村枝管藻葉綠體psbA基因的克隆及序列分析[J]. 海洋科學, 2009, 33(9): 20-24.

[9]吳曉微, 孫 雪, 陸開形, 等. 小球藻psbA基因的克隆與序列分析[J]. 水產(chǎn)科學, 2008, 27(7): 360-362.

[10]鐘珍萍, 吳乃虎. 植物光合基因psbA的結(jié)構(gòu)及表達調(diào)控綜述[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報, 1997, 26(3): 257-261.

[11]Wright F. The ‘effective number of codons’ used in a gene[J]. Gene, 1990, 87(1): 23-29.

[12]李 平, 白云鳳, 馮瑞云, 等. 籽粒莧蘋果酸酶 (NAD-ME) 基因密碼子偏好性分析[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2011, 17(1): 12-17.

[13]Sharp P M, Li W H. An evolutionary perspective on synonymous codon usage in unicellular organisms[J]. Journal of Molecular Evolution, 1986, 24(1-2): 28-38.

[14]Wong G K, Wang J, Tao L, et al. Compositional gradients inGramineaegenes[J]. Genome Research, 2002, 12(6): 851-856.