白宇 徐春燕 蘇建宇

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

一株弗氏鏈霉菌噬菌體的分離及其分子特性研究

白宇 徐春燕 蘇建宇

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

鑒定一株從泰樂菌素異常發(fā)酵液中分離出的烈性噬菌體SF1并研究其分子特性。采用雙層平板法分離純化弗氏鏈霉菌的噬菌體SF1，通過負(fù)染法電鏡觀察噬菌體SF1的大小和形態(tài)；測定噬菌體SF1對(duì)氯仿和異丙醇的敏感性分析其包膜結(jié)構(gòu)；通過SDS-PAGE分析噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白；提取噬菌體基因組DNA進(jìn)行限制性片段長度多樣性分析。噬菌體SF1的噬菌斑直徑約11-15 mm，邊緣整齊透明，為烈性噬菌體；SF1為長尾型，頭部為多面體，直徑約24-30 nm，尾長約52-64 nm，尾寬約為3-5 nm；對(duì)氯仿和異丙醇不敏感，無包膜；基因組為雙鏈DNA，大小約為35 kb；至少含有14種相對(duì)分子量為14.8-59.5 kD的結(jié)構(gòu)蛋白。

弗氏鏈霉菌 噬菌體 泰樂菌素

作為高效的動(dòng)物疾病防治藥物，泰樂菌素是一種十分重要的16元大環(huán)內(nèi)酯類畜禽用抗生素，是國家規(guī)劃重點(diǎn)發(fā)展的獸藥產(chǎn)品［1］，其工業(yè)生產(chǎn)菌株是弗氏鏈霉菌［2］。鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中易感染噬菌體，嚴(yán)重影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成，導(dǎo)致發(fā)酵異常，造成嚴(yán)重?fù)p失。因此，分離弗式鏈霉菌噬菌體并考察其生物學(xué)特性對(duì)泰樂菌素發(fā)酵生產(chǎn)中預(yù)防和控制噬菌體感染具有非常重要的意義。但是，目前發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中針對(duì)噬菌體感染的報(bào)道主要集中在谷氨酸、乳酸、丙酮、丁醇等產(chǎn)品［3，4］，國內(nèi)外對(duì)泰樂菌素發(fā)酵生產(chǎn)過程中噬菌體感染與防治的研究甚少，未見相關(guān)報(bào)道。

本研究針對(duì)從泰樂菌素異常發(fā)酵液中分離得到的一株烈性噬菌體，對(duì)其分子特性進(jìn)行研究，旨在

為弗氏鏈霉菌噬菌體的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 噬菌體來源 弗式鏈霉菌噬菌體SF1由本實(shí)驗(yàn)室分離自泰樂菌素異常發(fā)酵液。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 雙層平板培養(yǎng)基：上層高氏一號(hào)培養(yǎng)基（含0.7%瓊脂），下層高氏一號(hào)培養(yǎng)基（含2%瓊脂），液體培養(yǎng)基：菌絲體培養(yǎng)基［5］，SM緩沖液［6］；限制性核酸內(nèi)切酶Xho I、BamH I、Bgl II、Hind III、EcoR I和Xba I購自Fermentas公司；DNase I、RNase A、蛋白酶K和飽和平衡酚購自Sigma公司。DL15 000 DNA marker、λ DNA/Hind III marker等核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離 將泰樂菌素異常發(fā)酵液以12 000 r/min離心5 min去除菌體，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液即為噬菌體原液，置于4℃保存。

將宿主弗氏鏈霉菌與噬菌體原液混合后利用雙層平板法［6］培養(yǎng)48 h后，挑取直徑較大的噬菌斑與已在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的宿主菌液混合，于28℃，220 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后，12 000 r/min離心5 min去除菌體，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，再用雙層平板法觀察噬斑的形態(tài)。

1.2.2 噬菌體效價(jià)測定 純化后的噬菌體懸液按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的噬菌體液100 μL與弗氏鏈霉菌孢子懸液100 μL混勻，鋪雙層平板，28℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)噬菌斑。效價(jià)（pfu/mL）=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.2.3 噬菌體電鏡形態(tài)學(xué)觀察 噬菌體懸液經(jīng)濃縮、密度梯度離心和透析后制成高濃度噬菌體顆粒懸液［6］，將該懸浮液制片后采用磷鎢酸染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡（日立H-7650）下觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.4 噬菌體包膜分析 將噬菌體懸液100 μL加入到900 μL氯仿中，搖勻后于28℃分別作用0.5、1.5、3 h，靜置分層后取上層水相部分測定噬菌體效價(jià)，以未加氯仿的噬菌體懸液為對(duì)照。

將噬菌體懸液100 μL置于900 μL不同濃度的異丙醇（50%、75%、100%）中，搖勻后于28℃分別作用0.5、1.5和3 h，測定噬菌體效價(jià)，以未加異丙醇的噬菌體懸液為對(duì)照。

1.2.5 噬菌體蛋白SDS-PAGE分析 將濃縮純化的噬菌體顆粒充分加熱變性，于室溫冷卻后進(jìn)行SDSPAGE電泳，分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和4%。電壓設(shè)定90 V，待樣品電泳至分離膠界面時(shí)，調(diào)電壓至110 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)凝膠下緣，停止電泳。凝膠以考馬斯亮藍(lán)染色4 h，轉(zhuǎn)入脫色液脫色過夜后置于雙蒸水中保存并攝像。

1.2.6 噬菌體核酸提取和定性 噬菌體核酸提取方法參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，略有改動(dòng)。為測定核酸單雙鏈，按照文獻(xiàn)［8］的方法將提取的噬菌體核酸置于無菌EP管中，水浴加熱，每升高10℃，取1 μL核酸檢測其在260 nm處的吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3次，并繪制吸光值和溫度的曲線圖。

噬菌體核酸分別用DNaseⅠ、RNase A在37℃消化1 h后進(jìn)行電泳觀察結(jié)果。噬菌體核酸分別用6種限制性內(nèi)切酶Xho I、BamHⅠ、Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、EcoRⅠ和XbaⅠ于37℃酶切5 h，根據(jù)酶切圖譜鑒定核酸近似大小。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體SF1的噬菌斑特性

SF1在雙層平板上形成的噬菌斑（28℃倒置培養(yǎng)48 h）（圖1）顯示，噬菌斑形態(tài)、大小基本一致，直徑約11-15 mm，邊緣整齊透明，為無暈環(huán)透明圓斑，呈現(xiàn)典型的烈性噬菌體的噬菌斑特征。

圖1 弗氏鏈霉菌噬菌體SF1的噬菌斑

2.2 噬菌體SF1的電鏡觀察

純化后的噬菌體SF1顆粒經(jīng)負(fù)染后在透射電

鏡下觀察其形態(tài)，結(jié)果（圖2）顯示，噬菌體SF1與大多數(shù)鏈霉菌噬菌體形態(tài)相似，為蝌蚪狀噬菌體，由多面體的頭部和細(xì)長的尾部組成。頭部直徑約為24-30 nm，尾部相對(duì)細(xì)長，尾長約為52-64 nm，尾寬約為3-5 nm。按照國際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，簡稱ICTV）第8次報(bào)告的最新病毒分類系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)［9］，噬菌體SF1從形態(tài)上分類屬于長尾噬菌體科（Siphoviridae）。

圖2 噬菌體顆粒電鏡（30 000×）

2.3 噬菌體SF1的包膜分析

有些噬菌體在核衣殼之外具有包膜，包膜來源于宿主細(xì)胞膜，由脂類和蛋白質(zhì)組成，對(duì)氯仿等有機(jī)溶劑敏感，因此可以通過檢測噬菌體對(duì)氯仿的敏感性研究噬菌體是否具有包膜。用高比例氯仿處理噬菌體SF1，一段時(shí)間后測定噬菌體效價(jià)，結(jié)果（圖3）顯示，與對(duì)照相比，用氯仿處理噬菌體0.5-3 h后，噬菌體的效價(jià)均處在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)。將試驗(yàn)組與對(duì)照組數(shù)據(jù)兩兩進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果表明試驗(yàn)組和對(duì)照組的噬菌體效價(jià)相比無顯著性差異（α=0.05），說明噬菌體SF1對(duì)氯仿不敏感，推測噬菌體SF1的核衣殼外無脂質(zhì)包膜。

圖3 氯仿對(duì)噬菌體SF1效價(jià)的影響

通常異丙醇對(duì)親脂性病毒滅活效果好，而對(duì)親水性病毒效果較差。噬菌體SF1對(duì)異丙醇的抗性如圖4所示，噬菌體SF1經(jīng)異丙醇處理不同時(shí)間后下降1-4個(gè)數(shù)量級(jí)，說明噬菌體SF1對(duì)異丙醇有一定的敏感性，但并不能使噬菌體SF1完全滅活。推測噬菌體SF1的重要組成部分可能不含脂質(zhì)，符合細(xì)菌病毒dsDNA病毒、尾病毒目噬菌體的特點(diǎn)。

圖4 異丙醇對(duì)噬菌體SF1效價(jià)的影響

2.4 噬菌體SF1結(jié)構(gòu)蛋白分析

將高濃度噬菌體顆粒進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果（圖5）顯示，在凝膠上出現(xiàn)了14條蛋白質(zhì)條帶。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，純化的噬菌體顆粒SDS-PAGE電泳圖譜上清晰可見的往往是噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白［10］。經(jīng)Quantity One軟件分析，蛋白的相對(duì)分子量在14.8-59.5 kD之間，其中14.8、16.0和34.6 kD對(duì)應(yīng)的3條帶最明顯，提示14.8、16.0和34.6 kD所對(duì)應(yīng)的3種蛋白含量較高，可能是噬菌體SF1的主要衣殼蛋白。

2.5 噬菌體SF1的核酸類型分析

核酸酶對(duì)核酸的水解特征可用來判斷核酸類型。提取噬菌體SF1的基因組并分別用DNaseⅠ和RNase A消化，結(jié)果表明其核酸可被DNaseⅠ消化，而不能被RNase A消化（圖6），說明噬菌體SF1的核酸類型為DNA。這與目前已在GenBank上登錄的另外14株鏈霉菌噬菌體核酸類型一致。

雙鏈DNA加熱變性時(shí)雙螺旋解鏈會(huì)使其在260 nm處吸光值增高，稱之為DNA鏈的“增色效應(yīng)”（Hyperchromic effect）［8］。噬菌體SF1的基因組在

260 nm的吸光值隨溫度的變化如圖7所示，當(dāng)溫度的升高到80℃-90℃時(shí)，噬菌體DNA溶液在260 nm處吸光值顯著增高，說明噬菌體SF1的基因組類型為dsDNA。具備dsDNA病毒中的尾病毒目長尾病毒科的特征，并與按照形態(tài)初步分類的結(jié)果相同。

圖5 噬菌體SF1結(jié)構(gòu)蛋白的SDS-PAGE分析

圖6 噬菌體基因組經(jīng)核酸酶消化電泳圖

圖7 不同溫度下噬菌體基因組在260 nm的吸光值

噬菌體SF1基因組經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ、Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、EcoR I和Xba I六種限制性內(nèi)切酶酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析表明，噬菌體SF1基因組具有XhoⅠ、BamHⅠ、Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ的多個(gè)酶切位點(diǎn)，但不具有EcoRⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)（圖8）。噬菌體SF1的基因組能夠被XhoⅠ切割成3個(gè)片段；被BamHⅠ切割成4個(gè)片段；被Bgl Ⅱ切割成4個(gè)片段；被Hind Ⅲ切割成至少4個(gè)片段。由于這4種限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別并切割雙鏈DNA分子特定的核苷酸序列，所以進(jìn)一步證明了噬菌體SF1核酸類型為雙鏈DNA，與迄今所報(bào)道的鏈霉菌噬菌體情況一致。噬菌體SF1的基因組酶切圖譜與已發(fā)表的其它鏈霉菌噬菌體DNA的酶切圖譜類型有較大差異［11-15］，酶切圖譜顯示噬菌體SF1很有可能是一株未報(bào)道的新噬菌體。在已知的鏈霉菌噬菌體中，其基因組大多具有EcoR I酶切位點(diǎn)而沒有XhoⅠ酶切位點(diǎn)，且其他3種限制性內(nèi)切酶的酶切圖譜與噬菌體SF1的酶切結(jié)果也有很大差異；只有金色鏈霉菌噬菌體μ1/6的基因組有XhoⅠ酶切位點(diǎn)，但酶切片段大小與噬菌體SF1的不相同，而且噬菌體μ1/6的基因組不能被Hind Ⅲ酶切，噬菌體SF1的基因組則可以。

圖8 噬菌體SF1基因組限制性酶切圖譜

用λ DNA/Hind Ⅲ酶切片段作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ、Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切后得到不同片段的分子量相加，初步計(jì)算噬菌體SF1基因組分子量約為35 kb。

3 討論

近年來，隨著人們對(duì)鏈霉菌噬菌體研究工作的日益重視，研究內(nèi)容已由早期的分離鑒定逐漸發(fā)展為對(duì)其基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的深入研究。目前在GenBank中登錄基因組信息的鏈霉菌噬菌體有14株，其寄主分別為阿維菌素鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、金色鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌等，核酸類型全部為雙鏈DNA。與以λ噬菌體為代表的大腸桿菌噬菌體、乳酸菌噬菌體以及分支桿菌噬菌體的研究相比，目前對(duì)鏈霉菌噬菌體，尤其是工業(yè)鏈霉菌噬菌體的研究仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。因此，任何新的鏈霉菌噬菌體的分子特性研究都具有重要的學(xué)術(shù)意義。新的鏈霉菌噬菌體基因組信息也將有助于我們研究噬菌體宿主的相互交叉作用、開發(fā)鏈霉菌屬遺傳交換分析的分子工具以及開展輔助鏈霉菌屬的分類分群工作［16］。

通過對(duì)分離出的弗氏鏈霉菌噬菌體分子特性的研究并查閱相關(guān)文獻(xiàn)［11-15］，發(fā)現(xiàn)噬菌體SF1與已發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌噬菌體在形態(tài)特征和核酸酶切特性上均有所差異，因此噬菌體SF1很可能是一株未經(jīng)報(bào)道的新噬菌體。為全面認(rèn)識(shí)弗氏鏈霉菌噬菌體SF1的遺傳背景、基因調(diào)控方式以及與其宿主菌之間的相互關(guān)系，全基因組測序工作非常必要，相關(guān)研究正在開展。

4 結(jié)論

本研究首次分離出一株以弗氏鏈霉菌為宿主的噬菌體SF1，經(jīng)鑒定其為烈性噬菌體，屬于dsDNA病毒中的尾病毒目長尾病毒科。SF1的基因組大小約為35 kb，至少含有14種結(jié)構(gòu)蛋白，與已發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌噬菌體在形態(tài)特征和核酸酶切特性上均有一定的差異。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Identification and Molecular Characterization of a Phage from Streptomyces fradiae

Bai Yu Xu Chunyan Su Jianyu
（Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western，School of Life Science，Ningxia University，Yinchuan 750021）

It was to identify and explore the molecular characterization of a phage SF1, which was isolated from Streptomyces fradiae fermentation broth during the failed industrial production of tylosin. Phage SF1 was characterized by observing the shape of plaque, titering on double-layer agar culture plate. The morphology of SF1 was observed by the electron microscopic observation after negative staining. The sensitivity of the phage to chloroform and isopropyl alcohol was tested to detect its envelope. The structural proteins analysis of phage SF1 was carried out by SDS-PAGE. Restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis of genomic DNA was further performed to characterize the phage. Results showed that the plaque（11-15 mm in diameter）is neat and transparent. SF1 has a polyhedral head（about 24-30 nm in diameter）and a long tail（about 52-64 nm long and 3-5 nm wide）. It is insensitive to chloroform and isopropyl alcohol. The genome of SF1 consists of double-stranded DNA and is approximately 35 kb. Capsid protein analysis shows a higher level of 14 major protein bands ranging from 14.8-59.5 kD, which is presumed to be the structural proteins of SF1.

Streptomyces fradiae Phage Tylosin

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.028

2014-04-25

白宇，女，碩士研究生，研究方向：微生物與基因工程；E-mail：baiyu1119@163.com

蘇建宇，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)微生物；E-mail：su_jy@nxu.edu.cn