李猛 陳利飛 楊建樓 馬春玲

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室，濟南 250000）

產(chǎn)β-淀粉酶菌株的篩選及β-淀粉酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達

李猛 陳利飛 楊建樓 馬春玲

（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室，濟南 250000）

從淀粉廠附近的土壤中篩選到一株能夠利用淀粉的細菌，對該細菌進行生理生化檢測和16S rDNA同源性比對，分析該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。利用基因克隆技術(shù)得到了該菌株的β-淀粉酶基因，該基因含有一個約30個氨基酸的信號肽序列。將該β-淀粉酶基因重組進入質(zhì)粒pET-28a中，轉(zhuǎn)化進入E.coli BL21（DE3）中進行表達。檢測表達結(jié)果顯示得到了重組后的β-淀粉酶蛋白質(zhì)，重組酶的酶活力提高了53.9%。

β-淀粉酶 蠟狀革孢桿菌 克隆 表達

β-淀 粉 酶（1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2）與α-淀粉酶不同，它是一種外切型糖化酶，從淀粉的非還原性末端依次切下一個麥芽糖單位［1，2］。在小麥、甘薯、大豆和大麥等高等植物體中普遍存在β-淀粉酶，雖然細菌中大都含有α-淀粉酶，但含有β-淀粉酶的細菌并不是很多，Higashihara等［3］首次在巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中發(fā)現(xiàn)了β-淀粉酶，之后研究人員又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾種產(chǎn)孢子的革蘭氏陽性菌也能夠產(chǎn)生β-淀粉酶，如蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［4，5］、多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、高溫放線菌（Thermeoactinomyces sp.）、熱硫梭菌（Clostridium thermosulfurogenes）［6，7］和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［8］。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有些微生物能夠產(chǎn)生β-淀粉酶，但這些細菌關(guān)于β-淀粉酶的基因數(shù)據(jù)并沒有研究透徹。

β-淀粉酶的應(yīng)用非常廣泛，利用β-淀粉酶可進行麥芽糖的生產(chǎn)，麥芽糖在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)保健方

面都具有重要用途；β-淀粉酶可促進啤酒的糖化進程，降低生產(chǎn)成本［9，10］；也可應(yīng)用于工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域［11］。然而，目前工業(yè)生產(chǎn)所用的β-淀粉酶大都是利用植物提取的方法得到，價格較貴，限制了β-淀粉酶的應(yīng)用，因此篩選得到一株具有β-淀粉酶基因的菌株，并將該基因克隆至適合工業(yè)化生產(chǎn)的宿主菌中，使其能夠代替植物來源的β-淀粉酶顯得尤為重要。

本研究從淀粉廠附近的土壤中，分離到一株能夠利用淀粉的革蘭氏陽性菌D4，并對其進行生理生化和分子生物學(xué)方面的鑒定，初步認為該菌株是一株Bacillus cereus。利用克隆技術(shù)得到該菌株的β-淀粉酶基因完整的基因序列，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，得到β-淀粉酶的基因工程菌，對它的酶活力進行分析，旨在為得到高產(chǎn)β-淀粉酶的基因工程菌提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 受體菌大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-28a都為本實驗室保存。

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、EasyPfu DNA Polymerase和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、Taq DNA聚合酶以及提純和膠回收試劑盒和Ni-NTA購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。引物合成和基因測序也由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 篩菌樣品來源 篩菌所用土樣來源于濟南市長清區(qū)淀粉廠附近的土壤。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)β-淀粉酶菌株的初篩 稱取5 g土樣，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶中，震蕩20 min后靜置5 min，從中吸取1 mL置于事先滅好菌的試管中，再加入9 mL無菌水，并進行梯度稀釋至10-6待用。分別在10-4、10-5和10-6濃度下各取1 mL土壤稀釋液制成混菌平板，將培養(yǎng)皿放入37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在長出的菌落上滴加碘液，挑取有明顯水解圈的單菌落，進行斜面培養(yǎng)、保存。

1.2.2 產(chǎn)β-淀粉酶菌株的復(fù)篩 從斜面上取菌落接入50 mL LB培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃ 培養(yǎng)過夜。將菌液轉(zhuǎn)接到含有2%的直鏈淀粉的液體LB培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃ 培養(yǎng)過夜。對培養(yǎng)液進行離心、過濾膜處理后，進行高效液相色譜（HPLC）分析糖成分，以含有2%的直鏈淀粉的LB液體培養(yǎng)基為對照。

1.2.3 菌落的特征觀察和16S rDNA鑒定 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對得到的細菌進行菌落特征的鑒定。對得到的菌株進行培養(yǎng)后，利用試劑盒提取DNA。并以細菌16S rDNA通用引物為擴增引物進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃補充延伸10 min。擴增完成后，對反應(yīng)液進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果進行Blast比對，并進行同源性分析，利用軟件MEGA5.2進行發(fā)育樹的構(gòu)建?；?6S rDNA的高度保守性，通過測序，與基因庫中已有的菌種的16S rDNA序列進行同源比對，可判斷待測菌的種屬類別［12］。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)已公布的β-淀粉酶基因與NCBI比對結(jié)果，設(shè)計合成上下游引物：上游，5'-CGCGGATCCATGAAAAATCAGTTTCAATATTGTTGTATTGTTGTTTTG-3'；下游，5'-CCGCTCGAGTTACCACCAACTTACATGAGAGGTAGTCTTCAT-3'。其中劃線部位分別為BamH I和Xho I 酶切位點。以所得β-淀粉酶菌株D4的基因組為模板，用EasyPfu DNA Polymerase進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)30次；72℃補充延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物及濃度。將擴增得到的目的片段進行純化、雙酶切，并與同樣經(jīng)過雙酶切的表達載體pET-28a進行連接反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pETBA。將重組質(zhì)粒pET-BA轉(zhuǎn)入表達宿主E.coli BL21（DE3）中，經(jīng)Kan抗性篩選、菌落PCR篩選得到克隆菌株E.coli BL21（pET-BA）。

1.2.5 重組蛋白的表達 取構(gòu)建的E.coli BL21（pETBA）甘油保藏菌種500 μL接入含有50 μg/mL Kan的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。菌液轉(zhuǎn)接

入另一含有50 μg/mL Kan的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)7 h（達到菌株生長的對數(shù)中后期），添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），25℃ 180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，收集到的菌體用pH7.4的1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液15 mL重懸菌體，超聲破碎，超聲功率300 W，間歇時間6 s，破碎時間5 s，全程時間12 min。破碎后離心收集菌體，對上清液進行濃縮并SDS-PAGE分析。

1.2.6 Ni-NTA 親和層析 從4℃冰箱中取出保存的鎳柱，重懸填料并靜置使填料完全下沉到柱子的底部，將柱內(nèi)酒精溶液放出。加入5-10倍柱體積的Ni-Native-0緩沖液平衡填料，控制流速1 mL/min；加入1.2.5的大腸桿菌裂解液，保持30 min，控制流速1 mL/min，收集流出液；用5-10倍柱體積的Ni-Native-50緩沖液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；用5-10倍柱體積的Ni-Native-100緩沖液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；用5-10倍柱體積的Ni-Native-250緩沖液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；加5-10倍柱體積的Ni-Native-0緩沖液平衡柱子，并用30%的乙醇溶液保存填料，對收集到的酶液樣品進行SDS-PAGE分析。

1.2.7 糖成分分析 以2%的直鏈淀粉溶液為底物與所得粗酶液在50℃反應(yīng)24 h，高速離心，取上清進行0.22 μm濾膜過濾，過濾后的上清液進行高效液相色譜法（HPLC）檢測糖成分。

2 結(jié)果

2.1 菌株的初步篩選

從淀粉廠附近的土壤中取得5份土樣，每個樣品中分離到10株能夠利用淀粉的菌株，都有不同程度大小的透明圈出現(xiàn)（圖1），以得到的這50株能夠產(chǎn)生透明圈的菌株為基礎(chǔ)，進行復(fù)篩。

圖1 菌株初篩結(jié)果

2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

以含有2% 直鏈淀粉的培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，對培養(yǎng)后的培養(yǎng)液上清液進行高效液相色譜法（HPLC）分析培養(yǎng)基的麥芽糖含量。結(jié)果顯示大多數(shù)菌株都能夠產(chǎn)生麥芽糖（43株菌），但其中A2、D4、E7三株菌產(chǎn)生的麥芽糖含量較其他菌株要高，麥芽糖含量分別為9.74，9.98和9.36 g/L三株菌培養(yǎng)基糖含量測定見圖2，以麥芽糖含量最高者D4菌株進行進一步的鑒定。

2.3 菌落形態(tài)觀察

在普通固體LB培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，顯微鏡檢測（圖3），菌落形狀近似圓形，白色（似蠟燭顏色），直徑5-7 mm，菌落較軟，表面粗糙。通過顯微鏡觀察，該菌株呈桿狀，無莢膜。

2.4 菌株的生理生化鑒定結(jié)果

根據(jù)菌體的形態(tài)觀察，結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行鑒定試驗，結(jié)果如表1所示，菌株D4為革蘭氏陽性，V-P反應(yīng)呈陽性、不產(chǎn)生吲哚、與甲基紅反應(yīng)呈陰性，與葡萄糖和蔗糖反應(yīng)呈陽性，與乳糖反應(yīng)呈陰性，并可同時消化淀粉和糊精。

2.5 16S rDNA鑒定結(jié)果

將得到的D4菌株的16S rDNA序列進行Blast，并與同源性高的菌株利用軟件MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4）表明，目標(biāo)菌株D4與Bacillus cereus strain JBE0011的遺傳距離最近，同源性最高，且 D4與 Bacillus cereus strain JBE0011的 16S rDNA的同源性為99%。因此認為篩選到的D4菌株為Bacillus cereus。

2.6 β-淀粉酶基因的克隆與表達

利用所設(shè)計引物，以篩選所得菌株D4為模板進行克隆，凝膠電泳結(jié)果（圖5）顯示，所得β-淀

粉酶基因條帶大小約為1 700 bp左右。重組質(zhì)粒單酶切結(jié)果（圖6）和雙酶切結(jié)果（圖7）都證明該基因已經(jīng)克隆到質(zhì)粒pET-28a中，測序結(jié)果顯示該β-淀粉酶基因（包含信號肽序列）全長1 641 bp。與NCBI比對結(jié)果顯示，基因同源率為99%，所編碼的蛋白同源率為100%，可以確定該基因即為β-淀粉酶基因。通過SignalP-4.1對得到的β-淀粉酶序列進行分析，結(jié)果顯示該β-淀粉酶可能含有一個大約30個氨基酸長度的信號肽序列。在PDB數(shù)據(jù)庫中與已知的Bacillus cereus的β-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)：β-淀粉酶的催化功能結(jié)構(gòu)域是一個高度保守的（β/α）8圓桶結(jié)構(gòu)，酶的催化活性中心位于圓桶口［13］。該基因已經(jīng)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，編號為：KJ801918。

圖2 HPLC檢測結(jié)果

圖 3 菌株鏡檢結(jié)果

表1 生理生化鑒定結(jié)果

SDS-PAGE分析結(jié)果（圖8）顯示，E.coli BL21（pET-BA）與對照菌株相比，在50-60 kD之間確有蛋白質(zhì)的積累，由于在目的蛋白分子量附近有兩條帶明顯增加，因此對粗酶液進行純化。在本研究構(gòu)建的β-淀粉酶的N端含有一個由6個組氨酸組成的標(biāo)簽，我們利用組氨酸的咪唑基團與鎳離子有高度親和作用的原理，對β-淀粉酶進行純化。純化后酶液進行SDS-PAGE，結(jié)果如圖9所示。利用凝膠成像儀分析后，圖8和圖9比對結(jié)果顯示，圖8中50 kD到60 kD之間的兩條帶中的上方條帶與圖9中純化結(jié)果比較接近，兩條帶的大小都為56 kD，與已公

布的蠟狀芽孢桿菌β-淀粉酶分子大小相似。分析出現(xiàn)的兩條帶大小相差在3 kD左右，查閱文獻后認為可能是由于所克隆的蠟狀芽孢桿菌β-淀粉酶基因在大腸桿菌中表達、翻譯、合成的過程中被大腸桿菌自身的蛋白酶類局部降解，使該β-淀粉酶丟失了信號肽序列，導(dǎo)致一部分蛋白分子量變小。夏巧玉等［19］在對大豆耐熱β-淀粉酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達研究中，也出現(xiàn)了表達的蛋白分子量變小的現(xiàn)象。

圖4 基于D4和相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 β-淀粉酶基因的擴增

圖6 重組質(zhì)粒的單酶切

圖7 重組質(zhì)粒雙酶切

發(fā)酵E.coli BL21（pET-BA）所得粗酶液與2%淀粉溶液反應(yīng)24 h之后，經(jīng)HPLC分析結(jié)果如圖10所示。E.coli BL21（pET-BA）粗酶液利用淀粉產(chǎn)生

麥芽糖的濃度為15.39 g/L。定義β-淀粉酶酶活力單位U：1 min利用2%的淀粉產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物所需的酶量為一個酶活力單位。通過反應(yīng)計算出β-淀粉酶粗酶液酶活力為1 425 U，相對原始菌株而言，酶活力提高了53.9%。

圖9 純化后蛋白電泳分析結(jié)果

圖 10 HPLC分析結(jié)果

3 討論

β-淀粉酶在與底物相互作用時，會發(fā)生沃爾登轉(zhuǎn)位反應(yīng)（walden inversion），使α-型麥芽糖轉(zhuǎn)變?yōu)棣?型麥芽糖［1］。β-淀粉酶能夠降解直鏈淀粉成麥芽糖，并且在食品行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。展現(xiàn)明等［18］研究發(fā)現(xiàn)，β-淀粉酶的添加量對麥芽糖產(chǎn)率有較大影響，β-淀粉酶可與普魯蘭酶共同使用來生產(chǎn)結(jié)晶葡萄糖和55%-65%的高麥芽糖漿。從淀粉廠附近土壤中篩選到的菌株，經(jīng)HPLC分析顯示，在相同條件下，其中的A2、D4、E7這3株菌產(chǎn)生麥芽糖較多，濃度分別為9.74、9.98和9.36 g/L。

對產(chǎn)麥芽糖較多的菌株D4進行生理生化以及分子生物學(xué)鑒定。一般認為16S rDNA相似性大于99%的菌株可以判斷為同一個種。通過數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，該菌株與Bacillus cereus 的序列相似性為99%，并且在菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和生理生化特性都與Bacillus cereus一致，確定其為Bacillus cereus。Takashi等［14］從Bacillus cereus中克隆得到了β-淀粉酶基因，并分析認為完整的β-淀粉酶基因包括一個30個氨基酸的信號肽和一個與生淀粉結(jié)合的區(qū)域，認為該淀粉酶具有消化生淀粉的能力。

克隆的菌株D4的β-淀粉酶基因序列Balst結(jié)果顯示，與已公布的Bacillus cereus的β-淀粉酶基因的同源性為99%，氨基酸序列同源性為100%，并且該β-淀粉酶也同樣包含一個大約由30個氨基酸組成的信號肽序列。Reinikainen［15］將淀粉酶基因克隆到含有噬菌體啟動子的表達質(zhì)粒中，發(fā)現(xiàn)有17%的酶蛋白可以分泌到細胞外。Nakajima指出，能夠分泌到細胞外的淀粉酶蛋白分子中一些氨基酸可能與膜的通透性有關(guān)。王為先等［16］克隆的芽孢桿菌的β-淀粉酶基因未經(jīng)過改建即可以將表達產(chǎn)物全部分泌到大腸桿菌細胞外。而本試驗克隆的D4菌株β-淀粉酶基因也包含一段信號肽序列，Bacillus cereus與芽孢桿菌同為桿菌屬，但并沒有在細胞外檢測到β-淀粉酶酶活?？赡軆煞N菌的信號肽序列具有較大的差異。

就目前研究發(fā)現(xiàn)，在各種生物體中均發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切型的α-淀粉酶，然而只在植物和少數(shù)細菌中發(fā)現(xiàn)了β-淀粉酶［17］。夏巧玉等［19］成功地將大豆耐熱β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，并得到表達產(chǎn)物。楊華等［20］利用α凝集素系統(tǒng)首次將大麥β-淀粉酶成功展示在釀酒酵母表面，為全細胞催化劑研究與應(yīng)用打下了一定基礎(chǔ)。將真核細胞β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)入原核細胞進行表達具有一定難度，但就微生物產(chǎn)β-淀粉酶而言，目前已報道的微生物β-淀粉酶大多為中溫型，最適反應(yīng)溫度為40-60℃。鄒艷玲等［2］從土壤中篩選到一株高產(chǎn)β-淀粉酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最適作用溫度為65℃。蒙健宗等［21］認為在構(gòu)建基因工程菌方面，常用的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子和溫控誘導(dǎo)型啟動子均存在限制其實現(xiàn)工業(yè)化的缺點。改用由滲透壓啟動子Pro U控制的T7 RNA聚合酶（RNAP）合成的大腸桿菌宿主菌，并成功地表達了熱硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes的耐高溫β-淀粉酶基因，以NaCl作為誘導(dǎo)劑，濃

度為0.6 mol/L，酶反應(yīng)溫度達到70℃。利用微生物生產(chǎn)β-淀粉酶相比于植物更具有優(yōu)勢，微生物生產(chǎn)過程不受季節(jié)、原料等影響，容易實現(xiàn)自動化生產(chǎn)，所產(chǎn)β-淀粉酶性能穩(wěn)定、均一，這些都是以植物為原料進行β-淀粉酶生產(chǎn)所難以達到的［22］。從Bacillus cereus中克隆的β-淀粉酶基因所構(gòu)建的重組菌株E.coli BL21（pET-BA）能夠通過發(fā)酵法快速得到大量高活性的β-淀粉酶。

4 結(jié)論

本研究從土壤中篩選到一株具有β-淀粉酶活性的細菌D4，經(jīng)過生理生化以及分子生物學(xué)鑒定，確定為Bacillus cereus。將其β-淀粉酶基因克隆，在大腸桿菌中得到表達。重組菌E.coli BL21（pET-BA）產(chǎn)淀粉酶酶活力相對于原始菌株提高了53.9%。

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［22］黃純建, 米運宏.耐高溫微生物β-淀粉酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2008, 3（5）：361-365.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Isolation of Beta-amylase-producing Bacteria and Cloning，Expression of Beta-amylase Gene in Escherichia coli

Li Meng Chen Lifei Yang Jianlou Ma Chunling
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food & Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250000）

A bacterium which can degrade starch was isolate from the soil near the starch factory, was identified as Bacillus cereus by means of morphology and physiological-chemical characterization as well as 16S rDNA sequencing. Beta-amylase gene was cloned from the strain by PCR, and gene sequence was analyzed, which can encode a signal peptide which contains about 30 amino acids. The beta-amylase gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The results showed that recombinant bacteria can produce beta-amylase, and enzymatic activity increased by 53.9% compared with the parent.

Beta-amylase Bacillus cereus Isolate clone Expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.027

2014-05-22

山東省中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目（C010302）

李猛，男，碩士，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：limeng3530@163.com

馬春玲，女，副教授，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：machunling20022@163.com