夏淑春王學(xué)武張茹琴鄢洪海

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，青島 266109；2. 青島市植物保護(hù)站，青島 266100）

玉米彎孢葉斑病菌REMI白化突變體的篩選與致病性測(cè)定

夏淑春1王學(xué)武2張茹琴1鄢洪海1

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，青島 266109；2. 青島市植物保護(hù)站，青島 266100）

旨在探討玉米彎孢葉斑病菌致病機(jī)制及遺傳變異特性，利用限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)的基因整合技術(shù)（REMI）對(duì)Curvularia lunata進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得109個(gè)穩(wěn)定的突變株。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，質(zhì)粒pUC-JS已成功導(dǎo)入突變株中，轉(zhuǎn)化子既有單拷貝也有多拷貝，白化菌株單拷貝插入頻率為40%。此外，白化玉米彎孢葉斑病菌REMI突變株菌落顏色與野生菌株差異明顯，并且在致病性上也明顯弱于野生菌株；質(zhì)粒拯救、測(cè)序與blast分析推測(cè)插入可能導(dǎo)致FAD3基因功能喪失。

玉米彎孢菌葉斑病菌 REMI 白化菌株 致病性

我國(guó)是玉米生產(chǎn)大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)，產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)，年度間的豐產(chǎn)與歉收對(duì)國(guó)家糧食安全和人民生活都有重要影響。然而，近年來(lái)玉米彎孢葉斑?。跜urvularia lunata（Wakker）Boed.］危害嚴(yán)重，1996-2001年，連續(xù)幾年該病害大發(fā)生，僅遼寧省1996年發(fā)生面積就達(dá)16.8萬(wàn)hm2，嚴(yán)重地區(qū)減產(chǎn)50%以上，有1.6萬(wàn)hm2玉米絕產(chǎn)［1，2］。雖然近幾年該病害發(fā)生有所減輕，但個(gè)別地區(qū)仍造成嚴(yán)重?fù)p失［3，4］。據(jù)報(bào)道，玉米彎孢葉斑病菌自然條件下經(jīng)常有菌株白化現(xiàn)象，并且白化菌株致病性出現(xiàn)變異［5］。

在植物病原真菌中，Lu（1994）首先用REMI插入突變成功標(biāo)記了玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）Tox1毒素基因位點(diǎn)，隨后，該實(shí)驗(yàn)室利用質(zhì)粒拯救的方法克隆了突變基因，即線性聚乙酮醇（linear polyketide）合成酶的基因——PKS1，該酶是T-毒素合成所必需的。Tanaka等（1999）

從日本香梨黑斑病菌Alternaria alternata的984個(gè)REMI轉(zhuǎn)化體中鑒定出了3個(gè)不能致病，并喪失產(chǎn)生AK-毒素的突變體，分離出了參與AK-毒素生物合成途徑的兩個(gè)基因AKT1和AKT2［6］。目前REMI技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真菌尤其是植物病原真菌的研究，并因其高效性已成為植物病原真菌研究中的一種重要手段。本研究利用限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)整合（REMI）技術(shù)對(duì)該病菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，旨在探討玉米彎孢葉斑病菌致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米彎孢葉斑病菌菌株LZ-1（采自山東萊州）由本實(shí)驗(yàn)室提供，玉米自交系黃早四由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳研究室惠贈(zèng)。質(zhì)粒pUC-JS 由筑波大學(xué)植物病理研究室惠贈(zèng)（包含一個(gè)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因hph），有Hind Ⅲ、BamH I、Xab I、Kpn I等多種限制性酶等單酶切位點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 REMI突變體的制備

1.2.1.1 玉米彎孢葉斑病菌原生質(zhì)體的制備 玉米彎孢葉斑病菌原生質(zhì)體制備參考張建萍等［7］方法，并作適當(dāng)修改。1 g菌體加入25 mL pH7.0緩沖液，再加入5%的DTT，放置搖床上慢速振蕩30 min，然后用DF液離心洗滌兩次，吸除上清，加入5 mL高滲緩沖液制成懸浮液（1 mL懸浮液加入4 mL STC液：0.7 mol/L 山 梨 醇、Tris-HCl（pH7.5）10 mL、CaCl21.11 g、ddH2O補(bǔ)平至1 000 mL），然后加入4 g/L細(xì)胞壁降解酶于80℃，80 r/min振蕩4 h，形成原生質(zhì)體，用500目尼龍篩過(guò)濾，濾液2 000 r/min離心去除酶液，用STC液洗滌兩次，最后加入5 mL STC液制成原生質(zhì)體懸浮液。

1.2.1.2 質(zhì)粒提取及線性化 質(zhì)粒pUC-JS轉(zhuǎn)化 E. coli 菌株DH5α，質(zhì)粒提取和 Hind Ⅲ、BamH I和Kpn I酶切參考Akamatsu等［8］方法，略做改進(jìn)。

1.2.1.3 菌株基因組DNA提取 采用CTAB法提取玉米彎孢葉斑病菌基因組DNA，具體參照George等［9］的方法進(jìn)行。

1.2.1.4 REMI轉(zhuǎn)化 REMI轉(zhuǎn)化方法參考李波等［10］和張建萍等［11］方法，略加改動(dòng)。在50 mL離心管中加入線性質(zhì)粒40 μg、濃度為10 U/μL限制性?xún)?nèi)切酶 Hind Ⅲ 10 μL、STC液200 μL，配制成酶-質(zhì)?；旌弦海缓笙螂x心管中加入100-200 μL原生質(zhì)體懸浮液，并使其與酶-質(zhì)?；旌弦夯靹?，置冰上15-20 min，緩慢向管中加入2 mL 60% PEG，冰浴20-25 min，然后將離心管取出在28℃下放置10-20 min，加入 5 mL預(yù)冷的STC液，4℃下4 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入3 mL再生培養(yǎng)液，30℃下放置6 h。將培養(yǎng)液倒入培養(yǎng)皿中，然后加入約15 mL預(yù)先熔化好的，并且冷卻至50℃左右的固體再生培養(yǎng)基，邊搖晃邊加入潮霉素至濃度為300 μg/mL，在培養(yǎng)基表面鋪滿一層為止，每個(gè)平板約需10 mL，在28-30℃下，培養(yǎng)4-5 d，將能夠抗潮霉素的菌落轉(zhuǎn)移到預(yù)先倒好的含有潮霉素250 μg/mL的固體PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行2次篩選，獲得玉米彎孢葉斑病菌突變株。

1.2.2 玉米彎孢葉斑病菌REMI突變株鑒定

1.2.2.1 突變株的穩(wěn)定性測(cè)定 將2次篩選后獲得的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)接至不含潮霉素的PDA上，28℃下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，繼續(xù)轉(zhuǎn)接到不含潮霉素的PDA上，重復(fù)7次，再轉(zhuǎn)接到含有潮霉素的PDA上觀察培養(yǎng)。

1.2.2.2 突變株的PCR檢測(cè) 根據(jù)抗潮霉素基因序列設(shè)計(jì)合成引物（大連寶生物公司）：hph1上：5'-ATGAAAAAGCCTGAACTC-3'；hph2下：5'-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3'。

PCR擴(kuò)增程序：95℃變性5 min；94℃變性1 min，54℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。程序結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)化子的Southern blot檢測(cè) 隨機(jī)挑選5個(gè)轉(zhuǎn)化子，以野生型菌株LN-1作為對(duì)照，大量法提取轉(zhuǎn)化子和野生型菌株的基因組DNA，用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為探針，Hind Ⅲ酶切轉(zhuǎn)化子和野生型菌株DNA，用Hind Ⅲ酶切的λDNA作為Marker進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證［12］。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子生物學(xué)測(cè)定 選取白化突變株和野生菌株于PDA培養(yǎng)基（均為培養(yǎng)皿直徑9 cm，10 mL基質(zhì)）上培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌落直徑、比較相對(duì)產(chǎn)孢量（刮取培養(yǎng)皿中菌體，加入20 mL蒸餾水計(jì)算孢子濃度），并進(jìn)行培養(yǎng)性狀觀察和生長(zhǎng)發(fā)育性狀檢測(cè)；另

外，選取轉(zhuǎn)化子接種生長(zhǎng)至13葉期的玉米自交系黃早四植株，孢子懸液濃度為106個(gè)/mL（含有0.02% Tween20和2%蔗糖溶液），以相同濃度和相同處理的野生菌株（LN-1）為對(duì)照。噴霧接種后保濕培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)入正常管理，接種后7 d進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化子的致病性。

1.2.4 質(zhì)粒拯救 參照李鐵民等［13］方法。提取突變體LN-1-A的DNA，利用SacⅠ消化5-10 μg的DNA，37℃過(guò)夜，第二天觀察消化的彌撒程度，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提純化DNA，于8 000 r/min、4℃下離心10 min，取上清液于另一干凈的離心管中，加入1/10體積的3 mol/L NaAc（pH5.2）和70%的乙醇漂洗。溶解DNA于50-100 μL TE中，加100 μL的連接體系（T4 DNA連接酶），16℃溫室過(guò)夜。65℃處理10 min，滅活。在連接好的DNA體系中加入1/10 體積的NaAc和2倍體積的無(wú)水乙醇冰浴沉淀4 h，14 000 r/min離心20 min，去上清，用70%的乙醇漂洗，抽干后溶解于5 μL水中。將樣品稀釋5-10倍后，取1-2 μL于20-25 μL已經(jīng)制備好的感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）中，利用Gene Pulser進(jìn)行電激轉(zhuǎn)化，參數(shù)為電壓1.7 kv，時(shí)間為5.3 ms。將電激后的細(xì)胞混入800 μL的SOC中，37℃下振蕩培養(yǎng)1 h（80-100 r/min），取出后在含Amp（100 μg/mL）的LB平板上涂勻后，37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，從平板上挑出長(zhǎng)出的克隆點(diǎn)，在含Amp的LB培養(yǎng)基中搖菌提取質(zhì)粒，電泳檢測(cè)后測(cè)序（上海捷瑞公司）分析。

2 結(jié)果

2.1 原生質(zhì)體制備及純化條件的確定

試驗(yàn)表明采用改良Fries培養(yǎng)基最有利于原生質(zhì)體的制備，在6、12、24和36 h提取原生質(zhì)體檢驗(yàn)中，以24 h原生體的產(chǎn)量最高，為3.52×105個(gè)，36 h時(shí)檢測(cè)結(jié)果顯示原生體的數(shù)量下降，為0.52×105個(gè)，說(shuō)明菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備有影響。細(xì)胞壁降解酶的種類(lèi)及濃度可采用溶壁酶、崩潰酶、蝸牛酶和纖維素酶1∶1∶1∶1混合液，酶解6 h達(dá)到原生體數(shù)量高峰，10 h開(kāi)始下降，超過(guò)一定時(shí)間原生質(zhì)體開(kāi)始萎縮，且數(shù)量逐漸減少，采用三層擦鏡紙過(guò)濾后，用STC液洗滌后獲得需要的玉米彎孢葉斑病菌原生質(zhì)體。

2.2 原生質(zhì)體的再生

在玉米彎孢葉斑病菌（LN-1）菌絲加入裂解酶破壞細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體過(guò)程中，原生質(zhì)體隨著釋放時(shí)間長(zhǎng)短體積變化較大，最初開(kāi)始釋放時(shí)體積相對(duì)較小，隨著其在滲透液中時(shí)間的延長(zhǎng)，體積逐漸變大，原生質(zhì)體呈多角形，其平均直徑約為70 μm。為了確定原生質(zhì)體活性，將得到的原生質(zhì)體在0.7 mol/L的山梨醇為穩(wěn)定劑的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示玉米彎孢葉斑病菌LZ-1的原生質(zhì)體再生情況良好，經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)得到其再生率達(dá)到 30%，可滿足REMI轉(zhuǎn)化要求。

2.3 質(zhì)粒的提取和檢測(cè)

通過(guò)試劑盒提取質(zhì)粒 DNA，并用其單一酶切位點(diǎn) Hind Ⅲ對(duì)其進(jìn)行酶切，通過(guò)電泳檢測(cè)其分子量。酶切后得到的DNA分子量略大于5 000 bp，與 pUCJS 給出的圖譜5 080 bp相一致，圖上僅出現(xiàn)一條帶可以判斷質(zhì)粒DNA 酶切已經(jīng)完全，僅以線性的形態(tài)存在，并沒(méi)有 RNA 或是染色體 DNA 的污染。質(zhì)粒純度檢測(cè)為 OD260/OD280＝1.8-2.0，質(zhì)粒濃度為47.54 μg/μL，濃度和純度可滿足 REMI 轉(zhuǎn)化的要求。

2.4 REMI遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的獲得

在150 μL原生質(zhì)體懸浮液中加入5 μg酶切質(zhì)粒和45 U限制性?xún)?nèi)切酶在聚乙二醇（PEG）存在的條件下冰浴，即可將線性的質(zhì)粒插入到原生體的染色體DNA上。將轉(zhuǎn)化子在含200 μg/μL 潮霉素的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代，都能持續(xù)生長(zhǎng)，說(shuō)明潮霉素基因在轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定表達(dá)，初步確定轉(zhuǎn)化成功。經(jīng)過(guò)多次REMI誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，最終獲得109個(gè)REMI轉(zhuǎn)化子，其中包含5個(gè)白化突變株。白化突變體的菌落與野生黑色菌株差異明顯，菌絲細(xì)胞壁較為透明，菌絲相對(duì)細(xì)小，產(chǎn)孢數(shù)量變少。

2.5 突變體的檢測(cè)

2.5.1 突變體穩(wěn)定性的檢測(cè) 隨機(jī)選取10個(gè)轉(zhuǎn)化子在不含有潮霉素的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)7代后，再經(jīng)過(guò)第二次用含有200 μg/μL 潮霉素的PDA培養(yǎng)基篩選時(shí)，所有轉(zhuǎn)化子都可以正常生長(zhǎng)，因此可以初步認(rèn)為該109個(gè)轉(zhuǎn)化子即為 LN-1的REMI 轉(zhuǎn)化突變株。5個(gè)白化突變株經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后也證明是穩(wěn)

定遺傳的REMI轉(zhuǎn)化子。圖1顯示，在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)化子LN-1-A和LN-1-B菌落顏色呈灰白色至白色，與野生菌株黑色差異顯著，并且生長(zhǎng)速度也有明顯差異，一些菌絲的細(xì)胞壁較透明，只有少數(shù)色素積累，初步確定為黑色素合成途徑被阻斷突變體。

圖1 野生菌株與部分轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)

2.5.2 轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè) 以野生玉米彎孢葉斑病菌LN-1基因組DNA和5個(gè)白化轉(zhuǎn)化子基因組DNA作為模板，利用抗潮霉素基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖2）顯示，所有的轉(zhuǎn)化子都擴(kuò)增出目的條帶，以抗潮霉素基因的引物1和2進(jìn)行 PCR擴(kuò)增時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照pUC-JS（CK）相同，所有轉(zhuǎn)化子的特異帶都出現(xiàn)在510 bp，而出發(fā)菌株LN-1沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶。

圖2 利用hph引物對(duì)質(zhì)粒pUC-JS插入LN-1的PCR 檢測(cè)

2.5.3 轉(zhuǎn)化子Southern blot檢測(cè) 選取5個(gè)轉(zhuǎn)化子，以潮霉素基因作為探針，進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，雜交結(jié)果顯示5個(gè)轉(zhuǎn)化子都至少有一條雜交帶，并在5.0 kb處，再次證明質(zhì)粒pUC-JS（CK）已經(jīng)插入到LN-1染色體中。

Southern雜交的5個(gè)轉(zhuǎn)化子中，2個(gè)為單拷貝插入。在單拷貝轉(zhuǎn)化子中，1個(gè)菌株的雜交帶比目的條帶小，1個(gè)雜交帶比目的條帶大。在3個(gè)多拷貝插入的轉(zhuǎn)化子中，都有2個(gè)條帶，說(shuō)明質(zhì)粒pUC-JS在LN-1染色體上可有2個(gè)不同的基因插入位點(diǎn)。

2.6 突變體的生物學(xué)性狀研究

2.6.1 突變體菌株生長(zhǎng)速度的測(cè)定 對(duì)轉(zhuǎn)化子LN-1-A、LN-1-B和LN-1-C進(jìn)行生長(zhǎng)量測(cè)定，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)突變菌株的生長(zhǎng)速度（菌落直徑）與野生菌株差異不顯著，但是菌絲形態(tài)和菌落密度與野生菌株有明顯差異，轉(zhuǎn)化子菌絲一般都較纖細(xì)、透明，菌落中菌絲疏松，無(wú)黑色素和其它色素產(chǎn)生，而野生菌株除有黑色素產(chǎn)生外，還可以產(chǎn)生一些棕黃色素。

圖3 轉(zhuǎn)化子及野生菌株生長(zhǎng)速度曲線

2.6.2 突變體菌株產(chǎn)孢量的測(cè)定 對(duì)供試玉米彎孢葉斑病菌野生菌株LN-1及部分轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果表明，野生菌株和轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量存在明顯差異。圖4顯示，轉(zhuǎn)化子LN-1-A和LN-1-B與野生菌株比，產(chǎn)孢量明顯減少，而LN-1-C轉(zhuǎn)化子比野生菌株的產(chǎn)孢量還有所增加，說(shuō)明插入片段影響了玉米彎孢葉斑病菌的發(fā)育。

圖4 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢量測(cè)定

2.6.3 突變體菌株致病性檢測(cè) 為檢測(cè) REMI 轉(zhuǎn)化子（白色突變株）的致病性，選擇 REMI 轉(zhuǎn)化子 LN-

1-A、LN-1-B、LN-1-C和野生菌株LN-1分別接種相對(duì)感病的玉米自交系黃早四，致病性測(cè)定結(jié)果（圖5）表明，轉(zhuǎn)化子的致病性比野生菌株LN-1的致病性明顯減弱，菌株LN-1-A、LN-1-B、LN-1-C只在玉米葉片上形成幾個(gè)零星的褐色小斑點(diǎn)。

圖5 白色菌株和野生菌株接種黃早四后葉片癥狀

2.7 突變基因克隆

2.7.1 質(zhì)粒拯救 利用ScaⅠ酶切突變體LN-1-A、LN-1-B基因組DNA，之后利用T4連接酶連接，進(jìn)行質(zhì)粒拯救。由于ScaⅠ在介導(dǎo)酶HindⅢ的對(duì)側(cè)，因此拯救出的質(zhì)粒應(yīng)該去除了含有抗潮霉素基因（hph）。故在克隆體篩選過(guò)程中使用抗氨芐青霉素（Amp）作為抗性選擇標(biāo)記，而所得克隆體質(zhì)粒3.3 kb（圖6），說(shuō)明載體攜帶了部分的外源基因。

圖6 質(zhì)粒拯救后質(zhì)粒提?。ˋ）和酶切（B）鑒定

2.7.2 測(cè)序與blast分析 拯救的質(zhì)粒是載體pUCJS連接了一段外源基因的質(zhì)粒，在利用Amp作為引物對(duì)拯救質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序后，經(jīng)過(guò)與pUC-JS的序列比對(duì)，測(cè)定得到外源序列如圖7所示，共427 bp。對(duì)該序列進(jìn)行blast分析顯示，其與不飽和脂肪酸脫氫酶（FAD3）具有高度同源性。

圖7 外源序列

3 討論

據(jù)報(bào)道，在真菌遺傳轉(zhuǎn)化中，利用限制性?xún)?nèi)切酶和線性化質(zhì)粒方法，可提高其轉(zhuǎn)化效率［14，15］。本研究采用REMI方法，并通過(guò)最佳限制性?xún)?nèi)切酶種類(lèi)和濃度的選擇，獲得了玉米彎孢葉斑病菌較適宜轉(zhuǎn)化條件：用3 μg的線性化質(zhì)粒和40 unit Hind Ⅲ加入到 150 μL原生質(zhì)體里面，濃度為1×107/mL。采用該方法共獲得109個(gè)轉(zhuǎn)化子，其中有5個(gè)轉(zhuǎn)化子為白色菌株，致病性明顯減弱，與傳統(tǒng)的微生物誘變技術(shù)相比，明顯提高了轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化子單拷貝頻率。

本研究在所獲得的REMI 轉(zhuǎn)化子中發(fā)現(xiàn)致病性減弱與白化現(xiàn)象相關(guān)，即菌株白化可能導(dǎo)致病菌致病性減弱，這與鄢洪海等［5］報(bào)道相一致。鄢洪海等在遼寧省調(diào)查采集玉米彎孢葉斑病樣本時(shí)，發(fā)現(xiàn)了玉米彎孢葉斑病菌白化現(xiàn)象，并在致病性測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)了白化菌株致病力較野生黑色菌株弱的特性。通過(guò)REMI遺傳轉(zhuǎn)化玉米彎孢葉斑病菌獲得白化菌株轉(zhuǎn)化子，并通過(guò)致病性測(cè)定進(jìn)一步證明了玉米彎孢葉斑病菌這一特性，為以后玉米彎孢葉斑病菌致病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)質(zhì)粒拯救的方法克隆到了一個(gè)與不飽和脂肪酸脫氫酶（FAD3）具有高度同源性的一段基因序列。許多研究表明，不飽和脂肪酸的含量在高等植物抗性中有重要生理功能，它們不僅提供了大

量保守自由能，而且能影響應(yīng)答各種環(huán)境信號(hào)的作用［16-18］。ω-3脂肪酸脫飽和酶是不飽和脂肪酸合成途徑中催化脂肪酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，在模式植物擬南芥中人們根據(jù)定位差異將該酶進(jìn)行分類(lèi)，F(xiàn)AD3基因編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型ω-3脂肪酸脫飽和酶，F(xiàn)AD3在常溫下表達(dá)［19］。另外，在曲霉菌中，刪除一個(gè)編碼脂肪酸飽和酶基因后，就能阻礙脂肪酸的合成，同時(shí)拖延了孢子和菌絲的合成［20］。然而，目前尚不明確不飽和脂肪酸脫氫酶基因（FAD3）與菌株白化及弱致病現(xiàn)象的直接遺傳關(guān)系，需要今后利用基因敲除或基因沉默等方法進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究采用限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)整合方法（REMI）獲得了玉米彎孢葉斑病菌遺傳轉(zhuǎn)化子，其中既有單拷貝也有多拷貝轉(zhuǎn)化子。在轉(zhuǎn)化子中有一部分是白色突變體，也有野生色突變體，說(shuō)明插入位點(diǎn)不只是一個(gè)，至少存在2個(gè)以上插入位點(diǎn)。而玉米彎孢葉斑病菌白色突變體致病性普遍減弱，說(shuō)明菌株色素合成與其致病性關(guān)系密切。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Bending Spore of Corn Leaf Spot Fungus REMI Albino Mutant Screening and Determination of Pathogenic Transformation

Xia Shuchun1Wang Xuewu2Zhang Ruqin1Yan Honghai1
（1. College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109；2. Qingdao Plant Protection Station，Qingdao 266100）

To investigate bending spore corn leaf spot fungus pathogenic mechanism and genetic variation characteristics, this study using restriction enzymes mediated gene integration technology（REMI）of Curvularia lunata genetic transformation, received 109 stable mutant strains. PCR detection results showed that the plasmid pUC-JS has successfully imported mutant strains, into the son has both single copy and copy, albino strain single copy insert frequency was 40%. In addition, an albino corn bending spore bacteria leaf spot REMI contrast with wild strain of the mutant strains colony color, and also significantly weaker than wild on pathogenic strains. Plasmid save, sequencing and analysis of blast speculated that inserts may result in the loss FAD3 gene function.

Curvularia lunata REMI Albino mutant Pathogenic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.018

2014-06-05

山東省科技發(fā)展項(xiàng)目（2009GG10009022），山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2011CL005），山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（BS2009NY040）

夏淑春，女，副教授，研究方向：植物有害生物綜合治理；E-mail：xiashuchun@163.com

鄢洪海，男，博士，教授，研究方向：植物病理生理與分子生物學(xué)；E-mail：hhyan@qau.edu.cn