李晶冰張彩萍季 江崔盤(pán)根?

阿維A對(duì)系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞膠原合成及I型前膠原mRNA表達(dá)的影響

李晶冰1張彩萍2季 江2崔盤(pán)根2?

目的: 明確阿維A對(duì)系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞膠原合成及I型前膠原mRNA表達(dá)的影響。方法: 原代培養(yǎng)系統(tǒng)性硬皮病(SSc)患者皮膚成纖維細(xì)胞(FB)，使用不同濃度的阿維A(10－5、10－6、10－7、10－8mol/L)作用48 h，用羥脯氨酸法測(cè)定膠原的質(zhì)量濃度，RT－PCR法I型前膠原mRNA的表達(dá)。結(jié)果: 阿維A實(shí)驗(yàn)組FB膠原合成及I型前膠原mRNA的表達(dá)較對(duì)照組減少，且均與阿維A呈濃度依賴(lài)性關(guān)系。結(jié)論: 阿維A可能通過(guò)抑制FB I型前膠原基因的表達(dá)減少膠原合成。

系統(tǒng)性硬皮??； 阿維A； 成纖維細(xì)胞

系統(tǒng)性硬皮病(SSc)是以過(guò)量膠原在皮膚、肺、消化道等內(nèi)臟器官沉積為特征的結(jié)締組織疾病，引起皮膚和內(nèi)臟器官纖維化。成纖維細(xì)胞(FB)是參與SSc纖維化、硬化的主要細(xì)胞。阿維A屬第二代單芳香維A酸，有個(gè)案報(bào)道其治療SSc有效。本文通過(guò)體外試驗(yàn)觀察阿維A對(duì)SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞膠原分泌和I型前膠原mRNA表達(dá)的影響，探討其治療SSc可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；膠原酶(Calbiochem)；阿維A(重慶華邦公司)；羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Biospin RNA Simply P提取試劑盒(BioFlux)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BioFlux)；I型前膠原特異性引物(上海生工)；小牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 FB的來(lái)源及培養(yǎng) 采用原代分散細(xì)胞培養(yǎng)法。13例SSc患者(符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1980年分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn))，男1例，女2例，病程分別為9個(gè)月、1年、2年，Rodnan評(píng)分2分別為12、15、26。局麻下切取3例SSc患者前臂外側(cè)活動(dòng)性硬化皮損邊緣皮膚組織，置膠原酶溶液中，37℃消化4 h，分離表、真皮。將分離的真皮剪碎，放入膠原酶溶液中消化分散FB，將其過(guò)濾、離心、洗滌后，加入含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)。待梭形成纖維細(xì)胞布滿(mǎn)瓶底時(shí)，以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化細(xì)胞并傳代增殖。實(shí)驗(yàn)選用第4～8代細(xì)胞。

1.2.2 阿維A對(duì)FB膠原合成的抑制作用 羥脯氨酸是膠原蛋白中一種重要且含量穩(wěn)定的氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸含量計(jì)算膠原的質(zhì)量濃度。

將FB按4×104/孔密度接種24孔板。接種24 h后按下列濃度加入阿維A:10－5、10－6、10－7、10－8mol/ L。不含藥物的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。每種藥物濃度做3個(gè)平行孔。加藥后48 h，從每個(gè)孔各吸取1 mL培養(yǎng)基上清液，按羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定培養(yǎng)基中羥脯氨酸含量。在酶標(biāo)儀540 nm處檢測(cè)A值，樣品中羥脯氨酸質(zhì)量濃度(μg/mL)＝測(cè)定管A值×標(biāo)準(zhǔn)液濃度/標(biāo)準(zhǔn)液A值；樣品中膠原的質(zhì)量濃度(μg/mL)＝樣品羥脯氨酸濃度×7.46(羥脯氨酸換算為膠原時(shí)的計(jì)算常數(shù))。

1.2.3 阿維A對(duì)SSc Fb的I型前膠原mRNA表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SSc Fb接種至50 m L培養(yǎng)瓶，每瓶細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)。加入濃度分別為10－5、10－6、10－7、10－8mol/L的阿維A，以不加阿維A組作為空白對(duì)照。24 h后棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，用氯仿、異丙醇抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為:預(yù)變性94℃6 min－94℃1 min－55℃2 min－72℃2 min(35個(gè)循環(huán))－72℃5 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)加DNA Marker作為分子量對(duì)照，紫外透射儀下觀察并拍照。I型前膠原:上游引物，5'ctg gtc cca agg gta aca g3'，下游引物，5'gcc agg aga acc acg ttc3'，總長(zhǎng)285 bp。內(nèi)參照(β－actin):上游引物，5'gca ttg ctg aca gga tgc ag3'，下游引物，5'cct gct tgc tga tcc aca tc3'，總長(zhǎng)159 bp。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各電泳條帶A值。計(jì)算I型前膠原與β－actin光密度的比值，即為其相對(duì)光密度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行分析。結(jié)果以ˉx±s表示，采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 阿維A對(duì)FB膠原合成的影響 與空白對(duì)照組相比，阿維A對(duì)SSc患者Fb膠原合成有抑制作用，隨著藥物濃度增高，抑制作用增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。阿維A濃度在10－5mol/L時(shí)，其抑制作用最強(qiáng)。(表1)

表1 阿維A對(duì)SSc Fb羥脯氨酸和膠原蛋白合成的影響

2.2 阿維A對(duì)SSc Fb I型前膠原mRNA表達(dá)的影響

不同濃度藥物組及對(duì)照組SSc Fb的I型前膠原mRNA光密度值/β－actinmRNA光密度值(表2)。與空白對(duì)照組相比，10－5、10－6mol/L阿維A組I型前膠原mRNA表達(dá)下降(P＜0.05)。(表2、圖1)

3 討論

SSc是以皮膚硬化為主要臨床特征，累及多個(gè)內(nèi)臟器官纖維化的結(jié)締組織疾病，其病因尚不完全清楚。FB合成和維持細(xì)胞外基質(zhì)平衡的功能發(fā)生障礙，是疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因。通過(guò)干預(yù)異常的FB生物功能來(lái)治療SSc，可能為該病的治療開(kāi)辟新的途徑。維A酸類(lèi)藥物對(duì)正常人體皮膚成纖維細(xì)胞及瘢痕疙瘩、硬皮病等病理狀態(tài)下異常增殖的成纖維細(xì)胞均有調(diào)節(jié)作用。阿維A酸屬第二代單芳香維A酸，臨床研究表明，此藥物治療硬皮病有效。3

表2 阿維A對(duì)SSc Fb I型前膠原mRNA表達(dá)的影響

圖1 阿維A對(duì)SSc Fb的I型前膠原mRNA表達(dá)的影響

羥脯氨酸是膠原蛋白中一種重要且含量穩(wěn)定的氨基酸，在其他組織中含量甚微，因此，測(cè)量羥脯氨酸的含量是檢測(cè)膠原含量的可靠方法。本研究發(fā)現(xiàn)阿維A對(duì)Fb培養(yǎng)基中可溶性膠原的產(chǎn)生具有顯著抑制作用。與對(duì)照組相比，10－8～10－5mol/L阿維A對(duì)SSc Fb膠原合成均有抑制作用，隨著藥物濃度的增高，抑制作用增強(qiáng)，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。Ohtsuka等4使用放射性3H標(biāo)記的脯氨酸方法測(cè)定RA對(duì)SSc Fb膠原表達(dá)的影響，結(jié)果表明，全反式維A酸在10－6、10－5mol/L的濃度可分別抑制膠原合成達(dá)34%、49%，呈濃度依賴(lài)關(guān)系。13－順維A酸也有類(lèi)似作用。這與我們的結(jié)果相類(lèi)似。

SSc Fb主要合成I、III型前膠原，且I、III型前膠原比例較正常Fb增高，表明本病以I型前膠原增多為主。5Hitraya等6通過(guò)Northern雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)SSc Fb的I型前膠原ɑ鏈基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組增高2倍以上，使用藥物干預(yù)后選擇I型前膠原基因進(jìn)行檢測(cè)，可反映阿維A對(duì)SSc Fb膠原基因轉(zhuǎn)錄的影響。本研究發(fā)現(xiàn)10－6和10－5mol/L阿維A可以顯著抑制SSc Fb I型前膠原基因mRNA表達(dá)(P＜0.05)，因此可減少I(mǎi)型膠原蛋白在組織器官的過(guò)度沉積，減輕纖維化程度。10－6mol/L為口服阿維A可以達(dá)到的有效血藥濃度，7進(jìn)一步為其治療SSc提供了依據(jù)。

1薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù).北京:科學(xué)出版社，2001.442－444.

2Brennan P，Silman A，Black C，et al.Reliability of skin involvementmeasures in scleroderma.The UK scleroderma study group.Br JRheumatol，1992，31(7):457－460.

3 Varani J，F(xiàn)isher GJ，Kang S.Molecularmechanisms of intrinsic skin aging and retinoid－induced repair and reversal.J Investig Dermatol Symp Proc，1998，3(1):57－60.

4Ohtsuka T，Koibuchi N，Sakai H，et al.Simultaneous analysis of[3H]－thymidine uptake and alpha 1(I)procollagen mRNA expression in systemic sclerosis skin fibroblasts－an in situ hybridization study.Arch Dermatol Res，2000，292(5):248－255.

5Ohta A，Uitto J.Procollagen gene expression by scleroderma fibroblasts in culture.Inhibition of collagen production and reduction of pro alpha 1(I)and pro alpha 1(III)collagenmessenger RNA steady－state levels by retinoids.Arthritis Rheum，1987，30 (4):404－411.

6Hitraya EG，Jimenez SA.Transcriptional activation of the alpha 1(I)procollagen gene in systemic sclerosis dermal fibroblasts. Role of intronic sequences.Arthritis Rheum，1996，39(8):1347－1354.

7 Brindley CJ.Overview of recent clinical pharmacokinetic studies with acitretin.JDermatol，1989，178(2):79－87.

(收稿:2013－09－02 修回:2014－01－09)

Effect of acitretin on collagen synthesis and mRNA expression in cultured system ic sclerosis fibroblasts

LIJing-bing，ZHANGCai-ping，JIJiang，et al.Xuzhou Centrol Hospital，Xuzhou，221009

Objective:To determine the effect of acitretin on the collagen synthesis and themRNA expression of proα1(I)collagen in cultured systemic sclerosis fibroblasts(SSCFB).Methods:SSCFB were incubated with acitretin(10－5、10－6、10－7、10－8mol/L)for 48 hours.Hydroproline and RT－PCR were used tomeasure the content of collagen and themRNA expression of proα1(I)collagen.Results:The content of collagen and themRNA expression of proα1(I)collagen were lower than in acitretin group than in the control group，which were in a concentration－dependentmanner.Conclusion:Collagen synthesis can be inhibited by acitretin through suppressing proα1(I)collagenmRNA expression of SSc Fb.

systemic scleroderma；acitretin；fibroblasts

1江蘇省徐州市中心醫(yī)院皮膚科，221009

2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，江蘇南京，210042

?通信作者