包義君，王鵬飛，官彥雷，王維，張路陽，仇波，吳安華，王運杰

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，神經(jīng)外科研究所，沈陽110001）

Yes相關(guān)蛋白對人腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖的促進作用

包義君，王鵬飛，官彥雷，王維，張路陽，仇波，吳安華，王運杰

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，神經(jīng)外科研究所，沈陽110001）

目的探討Hippo信號傳導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄共激活子Yes相關(guān)蛋白（YAP）在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中調(diào)控作用。方法利用FACS分選得到CD133-和CD133+細胞，利用PCR和Western blot法檢測2組細胞間YAP表達的差異；利用小發(fā)夾RNA干擾CD133+細胞中YAP的表達，通過MTT法分析YAP干擾表達后人腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖情況。結(jié)果YAPmRNA和蛋白在CD133+細胞中表達明顯高于CD133-細胞；YAP干擾表達后CD133+細胞增殖能力減弱。結(jié)論YAP參與人腦膠質(zhì)瘤干細胞的功能調(diào)控，對人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖起到促進作用。

Yes相關(guān)蛋白；增殖；人腦膠質(zhì)瘤干細胞

人腦膠質(zhì)瘤是人類最常見顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，尤其是多形性膠質(zhì)母細胞瘤，即便經(jīng)手術(shù)、放療和替莫唑胺化療等綜合治療，預(yù)后仍然較差，5年存活率僅10%，而且易于復(fù)發(fā)［1］。人腦膠質(zhì)瘤干細胞是膠質(zhì)瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源，具有自我更新、無限增殖、向親本腫瘤細胞分化及引起腫瘤發(fā)生等特點，能抵抗放療和化療。因此探索膠質(zhì)瘤干細胞及其調(diào)控機制，對于膠質(zhì)瘤的治療具有重要意義。

Hippo信號傳導(dǎo)通路可通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡調(diào)控器官體積，在干細胞功能、腫瘤發(fā)生及組織再生等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［2～5］。其下游轉(zhuǎn)錄共激活子Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）可在上游激酶作用下經(jīng)過磷酸化調(diào)控，進而在細胞核內(nèi)外穿梭，在細胞核內(nèi)可結(jié)合各種轉(zhuǎn)錄因子參與細胞功能調(diào)控。YAP能與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)節(jié)胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞、間充質(zhì)干細胞和腫瘤干細胞特性［4，6］。盡管YAP在膠質(zhì)瘤中內(nèi)源性表達并可促進膠質(zhì)瘤細胞增殖［7～9］，但在膠質(zhì)瘤干細胞中的作用尚無報道。我們的研究結(jié)果表明，YAP能夠參與人腦膠質(zhì)瘤干細胞的調(diào)控，并對膠質(zhì)瘤干細胞的增殖起到明顯的促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及材料

胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)液（美國Gibco公司），B-27無血清和維生素A添加物、重組人表皮細胞生長因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）和重組人纖維母細胞生長因子b（recombinant human fibroblast growth factor-b，rhFGF-b，美國Invitrogen公司），鼠抗人CD133/2-PE（德國Miltenyi公司），兔抗人YAP多克隆抗體（#4912，美國Cell Signaling公司），兔抗人α-actin多克隆抗體（美國Abcam公司），YAP小發(fā)夾RNA（small hairpin RNA，shRNA）（sc-38637-SH）、對照shRNA（sc-108060）（美國Santa Cruz公司）。

1.2 人腦膠質(zhì)瘤干細胞分選和培養(yǎng)

手術(shù)切除人腦膠質(zhì)瘤新鮮組織標本20例，在PBS中進行破碎，經(jīng)酶消化后再經(jīng)過巴氏管抽吸分離，過濾得到單細胞懸液，在無血清DMEM/F12/B-27/rhEGF/rhFGF-b的干細胞培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)過夜以利于細胞表面抗原恢復(fù)，利用CD133抗體標記，然后流式細胞儀（FACS Vantage，美國BD公司）分選得到CD133+細胞，即人腦膠質(zhì)瘤干細胞。

1.3 腫瘤細胞球形成實驗

人腦膠質(zhì)瘤干細胞單細胞懸液在超低吸附細胞培養(yǎng)皿中干細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，定期補充EGF和bFGF，觀察腫瘤細胞球的形成和體積大小，即人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖能力。

1.4 實時熒光定量PCR

取CD133-和CD133+細胞加入TRIzol 1 mL打成勻漿，依次以氯仿、異丙醇、乙醇、DDW等抽提RNA，紫外分光光度計測定后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR system進行擴增分析。PCR反應(yīng)條件如下：95℃3.5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，擴增40個循環(huán)，4℃終止反應(yīng)。利用標準曲線法對目的基因的表達進行定量分析。序列如下：YAP上游：CAGCACAGCAAATTC TCCAA，下游：TGGATTTTGAGTCCCACCAT；內(nèi)對照Actin上游：CCCAGCACCATGAAGATCAAGATC，下游：CCTGCTTGGTGATCCACATCTGC。

1.5 Western blot法

CD133-和CD133+細胞回收后經(jīng)過裂解液（25 mmol/L Tris-HCl pH7.4，100 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，10%甘油，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L Na3VO4，5 mmol/L ZnCl2，100 mmol/L NaF，10 mg/mL抑肽酶，1 mg/mL亮肽素，1 mmol/L PMSF）中超聲裂解，經(jīng)蛋白定量后，取100 μg蛋白上樣，經(jīng)10%分離膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，利用YAP抗體和α-actin抗體孵育后清洗，二抗孵育后曝光顯影。

1.6 shRNA轉(zhuǎn)染

將YAP shRNA和對照shRNA質(zhì)粒按照Lipofectamine 2000使用說明轉(zhuǎn)染到CD133+細胞中，并通過Western blot檢測內(nèi)源性YAP蛋白的干擾效率。

1.7 MTT法

人腦膠質(zhì)瘤干細胞單細胞懸液于超低吸附細胞培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)后形成腫瘤細胞球，按照培養(yǎng)天數(shù)回收細胞球，經(jīng)酶消化后制成單細胞懸液，加入MTT溶液溫育后離心，待細胞貼壁后，加入二甲基亞砜，然后利用酶標儀檢測光密度值，判斷分析膠質(zhì)瘤干細胞的增殖能力。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，采用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤干細胞的分離

CD133被認為是人腦膠質(zhì)瘤干細胞的一個重要的表面標志物，盡管有文獻報道CD133-細胞也形成腫瘤細胞球和在免疫缺陷鼠中產(chǎn)生腫瘤，但是Brescia等［10］研究表明CD133對于維持膠質(zhì)瘤干細胞的特性具有重要作用，因此在我們的研究中將CD133+細胞群作為膠質(zhì)瘤干細胞進行研究。我們將手術(shù)切除得到的人腦惡性膠質(zhì)瘤腫瘤標本制成單細胞懸液，在干細胞培養(yǎng)條件下過夜培養(yǎng)后，利用CD133標記后FACS分選，得到CD133-和CD133+細胞群（圖1A）。將CD133-和CD133+細胞在干細胞培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)盡管CD133-細胞也可以形成較小的腫瘤細胞球，但是CD133+細胞在同等條件下形成腫瘤細胞球的能力更強（圖1B），而且連續(xù)傳代仍可形成腫瘤細胞球，表明我們分離得到的CD133+細胞具有腫瘤干細胞的增殖和自我復(fù)制特性。同樣，利用CD133+細胞得到的腫瘤細胞球消化后進行貼壁培養(yǎng)，該細胞可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞。

2.2 YAP在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達

Hippo信號傳導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄共激活子YAP參與干細胞的調(diào)控，但在膠質(zhì)瘤干細胞中的作用尚無報道，我們希望探討YAP在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中的作用。PCR的檢測結(jié)果（圖2A）表明YAPmRNA在CD133+細胞（人腦膠質(zhì)瘤干細胞）中表達明顯升高；Western blot的結(jié)果（圖2B）同樣表明YAP內(nèi)源性蛋白在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達相對于CD133-細胞明顯升高。這一結(jié)果表明，YAP參與了人腦膠質(zhì)瘤干細胞的調(diào)控作用。

2.3 YAP干擾表達對人腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖具有抑制作用

為了進一步分析YAP在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中的作用，我們利用shRNA技術(shù)干擾YAP的蛋白表達，通過MTT法分析YAP在人腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖中的作用。首先，我們通過Western blot檢測YAP shRNA的干擾效率，圖3A結(jié)果表明YAP shRNA能夠明顯干擾內(nèi)源性YAP的蛋白表達。我們利用YAP shRNA干擾以及對照shRNA干擾的CD133+細胞（人腦膠質(zhì)瘤干細胞）進行腫瘤細胞球形成實驗，并分析干細胞的增殖能力，圖3B結(jié)果提示YAP shRNA干擾后人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖能力明顯下降，圖3C提示腫瘤細胞球的大小有明顯差別。這一結(jié)果說明YAP參與了人腦膠質(zhì)瘤干細胞增殖能力的調(diào)控，并促進人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖。

圖1 人腦膠質(zhì)瘤干細胞分選及腫瘤細胞球的形成Fig.1 Sorting of human brain glioma stem cells and formation of tumor sphere

圖2 YAP mRNA和蛋白在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中的表達Fig.2 The mRNA and protein expression of YAP in human brain glioma stem cells

3 討論

作為原發(fā)于顱內(nèi)的惡性腫瘤人腦膠質(zhì)瘤，尤其是多形性膠質(zhì)母細胞瘤，即便經(jīng)過綜合治療，其中位生存期仍然僅有14.6個月，5年存活率僅10%，容易復(fù)發(fā)［1］。人腦膠質(zhì)瘤干細胞被認為是膠質(zhì)瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源，因此探討膠質(zhì)瘤干細胞的調(diào)控機制，并尋找可行的作用靶點對于膠質(zhì)瘤的治療具有重要意義。關(guān)于人腦膠質(zhì)瘤干細胞的腫瘤標志物一直存在爭議，但是CD133作為一種重要的標志物已被接受，雖然CD133-細胞液可以形成腫瘤細胞球，但是CD133+對于維持膠質(zhì)瘤干細胞特性具有重要意義［10］。因此，在本實驗中我們利用CD133標記后FACS分選得到CD133-和CD133+細胞進行相關(guān)實驗。

Hippo信號傳導(dǎo)通路的研究近年來十分活躍，該傳導(dǎo)通路進化過程高度保守，在哺乳動物中由三部分組成［2］：（1）上游調(diào)節(jié)因子，如NF2等；（2）核心部分，包括絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶如LATS等及銜接蛋白如MOB等；（3）下游轉(zhuǎn)錄共激活子，包括YAP及TAZ。Hippo信號通路在激活狀態(tài)下，細胞經(jīng)膜蛋白受體感受胞外生長抑制信號，經(jīng)胞內(nèi)激酶復(fù)合物磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，激活的LATS磷酸化YAP（主要是絲氨酸127位點）和TAZ（主要是絲氨酸89位點），磷酸化的YAP和TAZ滯留胞質(zhì)內(nèi)而不能進入胞核行使轉(zhuǎn)錄激活功能。反之，失活狀態(tài)下YAP和TAZ進入核內(nèi)，與TEAD和SMAD等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因表達。

圖3 YAP干擾表達能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖Fig.3 YAP interference inhibits the proliferation of human brain glioma stem cells

YAP在腫瘤發(fā)生及干細胞調(diào)控方面也得到廣泛的研究。YAP在人乳癌、肝癌、肺癌等［3，5］腫瘤組織中蛋白表達升高，在腦膠質(zhì)瘤中也有表達［7～9］，能促進腫瘤細胞增殖。在干細胞功能調(diào)控方面，YAP能與TEAD、SMAD和RUNX等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)包括腫瘤干細胞在內(nèi)的干細胞自我更新、增殖和分化［4，6］。YAP在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中是否具有調(diào)控作用尚未見報道，因此在本研究中我們希望探索YAP在人腦膠質(zhì)瘤干細胞中的調(diào)節(jié)作用。

我們利用CD133分選獲得CD133+細胞（人腦膠質(zhì)瘤干細胞），并通過YAP shRNA干擾CD133細胞中內(nèi)源性YAP蛋白的表達，腫瘤細胞球形成實驗以及MTT的分析結(jié)果都表明YAP能夠促進人腦膠質(zhì)瘤干細胞的增殖特性。至于YAP是否能夠同樣調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤干細胞自我更新、分化等其他干細胞特性尚待進一步研究。

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（編輯 陳姜）

Promotion Effectof Yes-associated Protein on the Proliferation ofHuman Brain Glioma Stem Cells

BAOYi-jun，WANGPeng-fei，GUANYan-lei，WANGWei，ZHANG Lu-yang，QIUBo，WUAn-hua，WANGYun-jie
（DepartmentofNeurosurgery，The FirstHospital，The Institute ofNeurosurgery，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the role of Yes-associated protein（YAP），which is the downstream co-activated factor of Hippo pathway，on the proliferation ofhuman brain glioma stem cells.MethodsFACS sorting was applied to obtain the CD133-and CD133+cells.The mRNAand protein expressions of YAP were examined by real-time fluorescence polymerase chain reaction and Western blot，separately.YAP of CD133+cells was then knocked down by shRNA and the proliferation was determined by MTT assay.ResultsThe expressions ofYAPmRNA and protein in CD133+cells were higher than that in CD133-cells.YAP interference inhibited the proliferation of human brain glioma stem cells.ConclusionYAP is involved in the regulation ofhuman glioma stem cells，which promotesthe proliferation ofglioma stem cells.

Yes-associated protein；proliferation；human brain glioma stem cells

R739.41

A

0258-4646（2014）11-0986-05

遼寧省博士科研啟動基金（20111095）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（教外司留［2013］1792號）

包義君（1975-），男，副教授，博士.

王運杰，E-mail：wangyunjie024@vip.sina.com

2014-09-29

網(wǎng)絡(luò)出版時間：