溫海超，劉暢，計婉瑩，沈起兵，王雨童，左敏，薛照輝

（天津大學化工學院，天津300072）

響應面法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的超聲提取工藝

溫海超，劉暢，計婉瑩，沈起兵，王雨童，左敏，薛照輝*

（天津大學化工學院，天津300072）

在單因素試驗基礎(chǔ)上利用中心組合（Box-Behnken）設(shè)計三因素三水平試驗，分析各因素的顯著性和交互作用，通過響應曲面法優(yōu)化超聲輔助提取鷹嘴豆異黃酮工藝。結(jié)果表明最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)78%、液料比40∶1（mL/g）、水浴溫度65℃、超聲時間40min，在此條件下鷹嘴豆異黃酮含量為0.150 7mg/g，與理論預測值基本相符。該工藝穩(wěn)定方便，適用于鷹嘴豆異黃酮的提取。

鷹嘴豆；異黃酮；響應面；三波長法；超聲提取

鷹嘴豆（CicerarietinuML），又名桃豆、雞豆，屬豆科鷹嘴豆屬植物，因其籽粒形似鷹嘴或雞頭而得名。鷹嘴豆是世界第二大消費豆類，產(chǎn)量居世界豆類第三位。目前在我國新疆、青島、甘肅、青海、陜西、寧夏及內(nèi)蒙古等地均有栽培[1]。鷹嘴豆除含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分外，還含有鷹嘴豆牙素A（biochanin A）、芒柄花黃素、大豆黃素等異黃酮類生物活性物質(zhì)，其中以鷹嘴豆牙素A含量最高（約占總異黃酮的30%）[2-3]。故而鷹嘴豆具有食用和藥用價值，具有降血壓，降血脂，降血糖等作用[4-6]，亦可作為營養(yǎng)強化劑與其他食品材料配合制備營養(yǎng)強化食品。

鷹嘴豆籽粒中鷹嘴豆牙素A含量較少，不易檢出，而發(fā)芽后鷹嘴豆芽素A會明顯提高[7]。目前檢測技術(shù)主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄板層析法等方法。高效液相色譜法需要設(shè)備昂貴，操作復雜，成本相對較高，但可精確測定異黃酮各組分的含量[8-9]；紫外分光光度法測定總異黃酮含量精度不高，但處理樣品操作簡單，檢測速度較快，費用較低[10]，故參考紫外分光光度法并加以改進，采用三波長法可以排除干擾物質(zhì)，提高檢測的靈敏性[1]。因此本試驗采用三波長紫外法檢測鷹嘴豆異黃酮含量，在單因素基礎(chǔ)上，利用響應曲面法對超聲輔助提取鷹嘴豆異黃酮各參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝，以期為鷹嘴豆中黃酮類化合物的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鷹嘴豆購自新疆木壘縣，烘干，粉碎機粉碎過60目篩備用。鷹嘴豆芽素A標準品（≥98%HPLC）上海如吉生物科技公司。石油醚、乙醇等為分析純。

1.2 鷹嘴豆芽素A標準曲線制備

準確稱取1.0mg鷹嘴豆芽素A標準品，用70%乙醇溶解，定容至10mL容量瓶中，配成0.1mg/mL鷹嘴豆芽素A標準溶液。精密移取0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL鷹嘴豆芽素A標準溶液置于100mL容量瓶中，定容。用紫外分光光度計掃描波長200nm～350nm，采用三波長掃描法，確定其最大吸收波長，并繪制鷹嘴豆芽素A標準曲線。

1.3 鷹嘴豆異黃酮含量測定

準確移取2mL待測樣品于10 mL具塞比色管中，用紫外分光光度計掃描波長，采用三波長掃描法，選取241、261、281 nm（λ1=241 nm，λ2=261 nm，λ3= 281 nm），在200 nm～350 nm進行掃描。計算ΔA。

根據(jù)鷹嘴豆芽素A標準曲線，按下式計算樣品中異黃酮的含量：

式中：C為標準曲線計算得到的異黃酮濃度，（μg/ mL）；V1為待測樣品總體積，mL；V2為測試樣品體積，mL；V3為測試樣品定容體積10，mL；M為稱取鷹嘴豆粉質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗

準確稱取鷹嘴豆1.000 0 g，置于試劑瓶中，以乙醇作為浸提溶劑，加入不同體積、不同濃度乙醇溶液，在不同溫度的恒溫水浴鍋中水浴1 h，放入超聲波清洗機中不同超聲時間處理，抽濾，加乙醇溶液定容至50mL，備用。依次對其進行乙醇濃度、液料比、提取溫度及提取時間的單因素實驗。

1.5 響應面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗得到的結(jié)果，采用Design Expert8.0軟件設(shè)計實驗，運用Box-Behnken的中心組合實驗，選擇對鷹嘴豆異黃酮提取具有明顯影響的3個因素：乙醇濃度（A）、液料比（B）和超聲時間（C），采用三因素三水平的響應面實驗設(shè)計，見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計Table1 The design of experimentby Box-Behnken

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0軟件進行多元回歸及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 異黃酮波長檢測

將10μg/mL鷹嘴豆芽素A標準品置于1cm石英比色皿中，在200nm～350nm進行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 鷹嘴豆芽素A紫外分光吸收光譜Fig.1 The light spectrograMof Biochanin A by UV-spectrophotometer

鷹嘴豆芽素A在261 nm處有明顯的吸收峰，試驗選取241、261、281 nm處波長，進行三波長測定鷹嘴豆芽素A的含量。

2.2 標準曲線繪制

鷹嘴豆芽素A標準曲線見圖2。

圖2 鷹嘴豆芽素A標準曲線Fig.2 Thestandard curveof Biochanin A

回歸方程為：Y=0.134 2x-0.010 2，R2=0.999 3。提示鷹嘴豆芽素A標準品在濃度為0.2μg/mL～2μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 單因素分析

2.3.1 液料比對鷹嘴豆異黃酮含量的影響

液料比對鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖3。

圖3 液料比對鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.3 Theeffectof solid solvent ratio on theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖3可知，鷹嘴豆異黃酮含量在液料比20∶1~ 30∶1之間，隨著液料比增加，增加了豆粉與溶劑接觸面的濃度差，提高了傳質(zhì)速率，異黃酮含量隨之增加。在超聲波提取下，當增加溶劑時，細胞破碎完全，異黃酮充分溶解。達到液料比1∶30（mL/g）后，異黃酮含量稍有所減少。豆粉中異黃酮已經(jīng)完全溶解，含量趨于穩(wěn)定。而當乙醇溶劑過多時，有可能其他物質(zhì)滲出，使溶液黏度增加，影響豆粉異黃酮提取。同時，溶劑使用量較大，溶劑本身對超聲波有一定的吸收損耗所致[11]。

2.3.2 乙醇體積濃度對鷹嘴豆異黃酮含量的影響

乙醇體積濃度對鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積濃度對鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.4 Theeffectof alcoholconcentrationson theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖4可知，乙醇體積分數(shù)50%~80%之間，隨著乙醇體積分數(shù)增加，異黃酮含量稍有減低。異黃酮苷元一般易溶于90%~95%的甲醇、乙醇等極性溶劑中，而異黃酮苷溶于60%乙醇溶液中。因此豆粉中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)，使用低濃度極性的溶劑提取效果較好。65%乙醇體積分數(shù)溶劑異黃酮含量達到最高，可能是65%乙醇溶劑既有利于以苷類形式存在的大部分黃酮類物質(zhì)浸出，又有利于一些游離的黃酮類物質(zhì)浸出[12]。之后隨著乙醇體積分數(shù)增加，含量減少，同時提取液顏色變化明顯。這可能是乙醇體積分數(shù)過高，豆粉中色素、脂溶性物質(zhì)、糖類及黏性物質(zhì)等物質(zhì)大量滲出，影響異黃酮提取，同時破壞了異黃酮的穩(wěn)定性[13]。故本實驗選擇60%、70%、80%乙醇體積分數(shù)，使用響應面法優(yōu)化實驗。

2.3.3 水浴溫度對鷹嘴豆異黃酮含量的影響

水浴溫度對鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖5。

圖5 水浴溫度對鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.5 Theeffectofwater bath teMperatureson theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖5可知，當水浴溫度在60℃~70℃之間，溫度越高，鷹嘴豆異黃酮含量越高，由于溫度升高加快了分子熱運動速度和提高了異黃酮滲透擴散溶解能力，加快物質(zhì)的溶出，但雜質(zhì)也被提取出。當水浴溫度超過75℃以后，異黃酮含量逐漸降低，可能溫度過高，異黃酮組織結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性被破壞，氧化分解，異黃酮含量降低。同時，溫度過高，溶劑揮發(fā)，造成溶劑損失，影響豆粉異黃酮提取效果[14]。本實驗選擇65℃水浴溫度，進行響應面優(yōu)化實驗。

2.3.4 超聲時間對鷹嘴豆異黃酮含量的影響

超聲時間對鷹嘴豆異黃酮含量的影響見圖6。

圖6 超聲時間對鷹嘴豆異黃酮提取的影響Fig.6 Theeffectof ultrasonic timeon theextracting efficiency of chickpea isoflavones

由圖6可知，超聲時間20min~25min之間，隨著時間增加，異黃酮含量逐漸增加，主要由于超聲波產(chǎn)生強烈的空化效應、機械振動、乳化、擴散、擊碎和攪拌作用，擊破植物細胞膜，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而增加了溶劑向細胞內(nèi)擴散，加速豆粉中異黃酮進入溶劑[14]。同時，超聲波的熱效應使水溫基本在57℃左右，對原料起到了水浴的作用。超聲波處理在開始段，時間與有效物質(zhì)的提取率呈正相關(guān)，在達到一定時間后提取效果不再明顯，由于隨著時間增加，超聲波對細胞膜破碎作用進一步加大，粘液等雜質(zhì)相應增加，使浸提液粘度增大，擴散速度降低，影響異黃酮含量[15]。本實驗選擇20、30、40min超聲時間，進行響應面優(yōu)化實驗。

2.4 響應面試驗結(jié)果

鷹嘴豆異黃酮提取的響應面分析實驗選取3個對提取效果影響較顯著的因素：乙醇濃度（A）、液料比（B）和超聲時間（C），根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗設(shè)計原理[16]，設(shè)計三因素三水平的響應面試驗。實驗設(shè)計了17組實驗，其中包括5組中心點重復實驗，數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示。

表2 Box－Behnken試驗設(shè)計及實驗數(shù)據(jù)結(jié)果Table2 The resultsof Box-Behnken experiMents

2.5 多元二次模型方程的建立與檢驗

利用Design Expert軟件對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到鷹嘴豆異黃酮提取的回歸方程為：Y=0.14-0.010 25A+0.003 25B+0.002 25C+ 0.003 75AB-0.003 75AC+0.002 75BC+0.001 125A2-0.003 38B2+0.004 125C2。

對響應面多元二次模型進行方差分析，見表3。

表3 二次多項模型方差分析結(jié)果Table3 ANOVA for Response SurfaceQuadraticModel

從表3數(shù)據(jù)中可知，本實驗所選用的二次多項模型P=0.016 5＜0.05，說明該模型二次方程顯著，表明本試驗方法是可靠的，該方程對模擬真實的三因素三水平的分析是可行的。模型失擬項在α=0.05水平上不顯著（P=0.453 2＞0.05），說明未知因素對本實驗的結(jié)果干擾小，其決定系數(shù)為0.878 3，校正決定系數(shù)為0.722 0，說明該二次多項模型71.14%的響應值的變化能解釋，有總變異的27.80%不能用該二次多項模型來解釋，表明該模型的擬合度一般，用此模型可以對鷹嘴豆異黃酮提取工藝過程進行優(yōu)化[17]。

對該回歸方程的回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，見表4。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table4 Thesignificant test resu ltsof regression coefficients

從表4中數(shù)據(jù)可知，實驗中A對鷹嘴豆異黃酮含量的影響顯著，表明在鷹嘴豆異黃酮提取工藝過程中，乙醇濃度對異黃酮提取有顯著的影響。

2.6 模型驗證實驗

根據(jù)Box-Behnken實驗得到的結(jié)果以及二次多項回歸方程，并利用Design Expert8.0軟件，獲得本實驗鷹嘴豆異黃酮含量最高時的各因素的最佳提取條件為乙醇體積分數(shù)78.48%、液料比40∶1、超聲時間40min。在此條件下，鷹嘴豆異黃酮含量為0.1511mg/g。對此優(yōu)化提取條件進行驗證實驗，考慮到操作方便，采用乙醇體積分數(shù)78%、水浴溫度65℃和超聲時間40min，重復進行3次，測得鷹嘴豆異黃酮含量為0.151 2、0.150 5、0.150 3mg/g，平均值為0.150 7mg/g，與理論計算值的誤差在±1%以內(nèi)，該模型能較好地預測實際的鷹嘴豆異黃酮提取情況[18-19]。

3 結(jié)論

本文在單因素實驗基礎(chǔ)上，以鷹嘴豆異黃酮含量為響應值，通過響應面法優(yōu)化超聲輔助提取鷹嘴豆異黃酮工藝。選擇三波長紫外分光光度法檢測異黃酮含量，有效地提高了鷹嘴豆異黃酮測定方法的靈敏性，并消除色素等脂溶性物質(zhì)對測定結(jié)果的干擾，具有快速、重復性好、精密度高等特點。通過實驗確定鷹嘴豆異黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)78%、液料比40∶1、水浴溫度65℃、超聲時間40min，鷹嘴豆異黃酮含量為0.151 1mg/g。在此條件下進行的驗證試驗獲得異黃酮含量為0.150 7mg/g。

吳敏[1]采用三波長紫外分光光度法測得鷹嘴豆異黃酮類物質(zhì)含量為0.5mg/g；朱燕超[11]利用超聲輔助提高異黃酮含量，測得為14.49mg/g；程珍[10]測得鷹嘴豆得率為0.016%，發(fā)芽后得率為5.057%，說明發(fā)芽可大幅度提高鷹嘴豆異黃酮含量；田春元[9]應用高效液相色譜測得鷹嘴豆芽素A含量為7.7μg/g。本試驗中測得異黃酮含量比HPLC測得較高，而比其他檢測含量較低，說明本方法可以較好的測定了鷹嘴豆中異黃酮的含量，為鷹嘴豆異黃酮更好利用和檢測提供了參考。與傳統(tǒng)法相比，優(yōu)化后的超聲提取顯著提高了鷹嘴豆異黃酮的含量，該提取工藝穩(wěn)定環(huán)保，有明顯的優(yōu)勢和較好的應用前景。

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OptiMization of Ultrasonic Extraction of Isoflavone froMChickpea Using Response Surface Methodology

WENHai-chao，LIUChang，JIWan-ying，SHENQi-bing，WANGYU-tong，ZUOMin，XUEZhao-hui*
（SchoolofChemicalEngineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Based on single factor testaccording to the centralcomposite（Box-Behnken）to design three factors and three levels，significantand interaction on various factorswere analyzed to optimization of the ultrasonic assisted extraction ofchickpea Isoflavonesby responsesurfacemethodology.The resultsshowed that theoptimuMtechnologicalmethod toextracted isoflavones froMchickpeawasas follows：ethanolconcentration 78%，liquidsolid ratio 40∶1，extracting temperature 65℃and ultrasonic extraction time 40min.In this case，the extracting ofisoflavone reaches0.1507mg/g，under theseconditions，contentof flavonoids froMchickpeawas0.1507mg/g，which was basically accorded with theoretical prediction value.The proposed technology is stable and convenient，and suitable for isoflavonesextraction ofchickpea.

Cicer arietinuML；isoflavone；response surfacemethodology；three-wavelengthmethod；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.18.008

2014-09-15

天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃

溫海超（1990—），女（漢），在讀碩士，研究方向：天然產(chǎn)物化學及功能性食品研究。

*通信作者：薛照輝（1973—），男（漢），副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學及功能性食品研究。