丁娟芳，樊艷，呂玉珍，韋林洪

（1.揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210023）

超高效液相色譜法快速測(cè)定原料乳中的雙氰胺

丁娟芳1，樊艷2，呂玉珍1，韋林洪1

（1.揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210023）

建立了超高效液相色譜檢測(cè)原料乳中雙氰胺的分析方法。采用甲醇提取樣品中的雙氰胺，HILICS色譜柱為分析柱，流動(dòng)相為乙腈-10mmol/L乙酸銨（90∶10，體積比），流速0.4mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。雙氰胺在0.006mg/L～10.0mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=90.336x+0.994 6，R2=0.999 9。方法檢出限為0.05mg/kg，不同添加水平平均回收率在87.0%～91.6%之間，變異系數(shù)＜3.84%（n=6）。此方法操作簡(jiǎn)便，可在15min內(nèi)完成快速檢測(cè)，適用于原料乳中雙氰胺殘留的快速篩查。

超高效液相色譜；雙氰胺；原料乳

雙氰胺（Dicyandiamide），化學(xué)式C2H4N4，又名二氰二氨，是氰胺的二聚體。雙氰胺能夠抑制土壤中硝化細(xì)菌的活動(dòng)，從而使氮肥在土壤中的轉(zhuǎn)化速度得到調(diào)節(jié)，減少土壤中氮的流失，減少溫室氣體排放[1-2]。2013年1月，新西蘭部分乳制品被爆檢測(cè)出少量雙氰胺，再次引起了人們對(duì)乳品安全的關(guān)注?，F(xiàn)有資料顯示，雙氰胺本身屬于低毒物質(zhì)[3]，目前也還沒(méi)有人或動(dòng)物食用了雙氰胺后導(dǎo)致危害的報(bào)道，但由于缺乏官方的毒理數(shù)據(jù)，其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果仍未知[4]。作為硝化抑制劑或氮肥增效劑，雙氰胺廣泛用于中國(guó)、美國(guó)、日本、新西蘭等國(guó)家的化肥工業(yè)中。鑒于目前國(guó)內(nèi)外乳制品質(zhì)量安全事件頻發(fā)，乳產(chǎn)品供應(yīng)鏈的源頭—原料奶的質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控就必須更加全面和嚴(yán)格，原料奶的雙氰胺含量監(jiān)測(cè)和篩查就顯得尤為必要。

目前，乳粉中雙氰胺的測(cè)定方法已有報(bào)道，多利用液相色譜-質(zhì)譜法[5-8]進(jìn)行檢測(cè)，硬件配置門(mén)檻較高，而原料乳中雙氰胺的檢測(cè)方法少見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了一種高效、快速的測(cè)定原料乳中雙氰胺的高效液相色譜檢測(cè)方法，整個(gè)測(cè)定過(guò)程能在15min內(nèi)完成，適用于檢測(cè)機(jī)構(gòu)、乳品工廠等單位對(duì)原料乳中雙氰胺的初步篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD）：美國(guó)Agilent公司；FA1604電子天平：上海天平儀器廠；Milii-Q超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司。

雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；乙醇、丙酮（色譜純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水機(jī)制備。

1.2 色譜條件

AcclaimTMHILIC-10色譜柱（2.1×150mm，3μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μL；流動(dòng)相：乙腈：10mmol/L乙酸銨（90∶10，體積比），乙酸銨水溶液用10%冰醋酸溶液調(diào)至pH6.0；流速：0.4mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g，置于50mL容量瓶中，用甲醇定容得到500mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成0.006、0.02、0.08、0.4、0.8、4.0、10.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3.2 樣品的制備

稱取1 g原料奶（精確至0.001 g），置于25mL具塞刻度試管中，加1mL 70℃熱水混勻，加入甲醇定容至滿刻度，劇烈振蕩3min后靜置5min，上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，待HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

雙氰胺極性較強(qiáng)，可溶解于水、甲醇、乙醇等極性溶劑[9]，本實(shí)驗(yàn)選擇了甲醇、乙醇、丙酮和乙腈4種溶劑對(duì)樣品中的雙氰胺進(jìn)行提取，樣品加標(biāo)量為1mg/kg，每組條件平行測(cè)定6次。加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同處理方法的回收率（n=6）Table1 The results of recovery of different approaches（n=6）

結(jié)果顯示，甲醇提取回收率最高，且與其他提取條件差異顯著（p＜0.05），故選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

雙氰胺是極性小分子化合物，在C18柱中幾乎無(wú)保留。HILIC色譜柱基于親水相互作用，能為強(qiáng)極性和親水性化合物提供合適的保留。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)標(biāo)樣和處理液分離效果的嘗試，選擇了HILIC柱作為分析色譜柱。對(duì)雙氰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液在190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在218 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，考慮到甲醇和乙腈的紫外吸收干擾，故選擇了相對(duì)紅移的波長(zhǎng)230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，并采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行光譜掃描，以保留時(shí)間和三維光譜圖相似性系數(shù)進(jìn)行定性。按上述波長(zhǎng)條件，考察了不同配比的乙腈和乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相的分離效果，最終選擇了乙腈-10mmol/L乙酸銨（90∶10，體積比）作為流動(dòng)相。色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 雙氰胺標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of Dicyandiamide

圖2 空白樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample

圖3 加標(biāo)樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample spiked with Dicyandiamide

2.3 方法線性范圍、檢出限、回收率和精密度

圖4 雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of dicyandiamide

參照上述實(shí)驗(yàn)條件以標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行分析，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度范圍在0.006mg/L～10.0mg/L內(nèi)，質(zhì)量濃度和峰面積有良好的線性關(guān)系（圖4）。方法檢出限以噪聲面積的三倍計(jì)算，為0.05mg/kg。在上述前處理和色譜條件下，在陰性樣品中添加標(biāo)樣，進(jìn)行不同水平的添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，每組條件測(cè)定6次。結(jié)果顯示，不同添加水平下，加標(biāo)回收率均值在87.0%～91.6%之間，變異系數(shù)＜3.84%（表2）。結(jié)果表明本方法測(cè)定準(zhǔn)確，加標(biāo)回收率高，精密度好，能夠很好地滿足實(shí)際樣品的測(cè)定。

表2 雙氰胺加標(biāo)回收率和精密度Table2 Recoveries and repeatability of dicyandiamide

3 結(jié)論

本文應(yīng)用超高效液相色譜儀測(cè)定了原料乳中雙氰胺的含量，整個(gè)檢測(cè)可在15min內(nèi)完成，具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，方法精密度和回收率能滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的要求，可實(shí)現(xiàn)對(duì)原料乳中雙氰胺殘留的快速篩查。

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Rapid Determination of Dicyandiamide in Raw Milk by Ultra High Performance Liquid Chromatography

DING Juan-fang1，F(xiàn)AN Yan2，Lü Yu-zhen1，WEI Lin-hong1
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.College of Food Science&Engineering of NJNU，Nanjing University of Finance Economics，Nanjing 210023，Jiangsu，China）

An ultra high performance liquid chromatography method was developed for determination of dicyandiamide in saw milk.Dicyandiamide was extracted by methanol，the sample was isolated on a HILICcolumn，using a mobile phase made up of acetonitrile and 10mmol/Lammonium acetate（90∶10，V/V）at a flow rate of 0.4mL/min，and detected at 230 nm.Dicyandiamide was well separated with a good linear relation ship in the range of 0.006 mg/L-10.0 mg/L，caffeine standard curve equation:y=90.336x+0.994 6，R2=0.999 9.The detection limit was 0.05mg/kg，recovery rate was in the range of 87.0%-91.6% at several spiked levels，and the coefficient of variance of method was less than 3.84%（n=6）.This method is simple，the whole determination process was completed with in 15min，making it applicable for analysis in dicyandiamide monitoring programmes in saw milk.

ultra high performance liquid chromatography；dicyandiamide；saw milk

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.024

2013-11-13

丁娟芳（1981—），女（漢），講師，碩士，主要從事食品生物技術(shù)研究。