張繼強(qiáng)　張　燕　尹曉麗　楊　萍　張海峰　郭亞玲　陳衛(wèi)東

糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，研究證實(shí)炎癥和免疫反應(yīng)在DN進(jìn)展中起重要作用[1]。單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)作為單核/巨噬細(xì)胞特異性趨化因子，可引起炎癥細(xì)胞在腎組織中廣泛浸潤，激活炎癥反應(yīng)而參與DN發(fā)生發(fā)展[2]。結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為轉(zhuǎn)化生長因子β的下游效應(yīng)因子，在刺激系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成、促腎臟纖維化方面發(fā)揮作用，可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞產(chǎn)生與DN相關(guān)的病理改變[3]。雷公藤多苷(TG)因具有獨(dú)特的抗炎及免疫抑制作用而被應(yīng)用于DN臨床治療，但至今對(duì)其具體作用機(jī)制的研究仍較少。本研究即通過觀察早期DN大鼠腎組織CTGF及MCP-1表達(dá)情況及不同劑量TG對(duì)其的影響，探討兩者在DN發(fā)病中的作用機(jī)制，同時(shí)觀察TG的作用機(jī)制及不同劑量TG對(duì)DN的治療效果。

材料與方法

藥物及試劑雷公藤多苷片購自上海復(fù)旦復(fù)華，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma；兔抗大鼠CTGF、MCP-1一抗、小鼠抗大鼠單核巨噬細(xì)胞抗原(ED-1)單克隆抗體、生物標(biāo)記山羊抗兔及小鼠IgG及DAB顯色劑盒等購自北京奧博森；Trizol及RT-PCR試劑盒分別購自美國Invitrogen及fermentas公司，CTGF、MCP-1及β-actin引物合成于上海生工。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠共32只，體重180～200g，購自蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

動(dòng)物模型制備、分組及治療大鼠按數(shù)字隨機(jī)法分正常對(duì)照(NC)組、糖尿病腎病(DN)組、小劑量TG干預(yù)(TG1)組及雙倍劑量TG干預(yù)(TG2)組各8只。造模組予以高糖高脂飼料(普通飼料+10%豬油+20%蔗糖+3%膽固醇)喂養(yǎng)4周后，予STZ 55 mg/kg一次性腹腔注射；NC組予以普通飼料喂養(yǎng)，腹腔注射枸櫞酸鹽緩沖液。72h后血糖儀測定血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功，24h尿量大于造模前50%及24h尿蛋白定量(UTP)>30 mg為DN模型制備成功。造模成功后干預(yù)組予藥物灌胃，TG1組按5 mg/(kg·d) [相當(dāng)于成人劑量1 mg/(kg·d)]灌胃，TG2組按10 mg/(kg·d)灌胃，每晨1次，每周據(jù)體重變化調(diào)整給藥劑量；NC組和DN組每日以生理鹽水灌胃；干預(yù)時(shí)間共8周，模型鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均不應(yīng)用降糖藥。

標(biāo)本收集DN大鼠造模前后每周測量鼠重，造模后及第8周末代謝籠收集24h尿液待檢，并稱重后心臟采血處死大鼠，離心分離血清-20℃保存待檢，同時(shí)留取兩側(cè)腎臟，分別予液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆眉?0%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋制片待作病理檢測。

觀察指標(biāo)

一般情況及血、尿生化指標(biāo)檢測定期檢測大鼠體質(zhì)量、尿量，收集大鼠血標(biāo)本檢測血白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、UTP等指標(biāo)，血糖采用羅氏公司血糖儀測定。

組織學(xué)及免疫組化染色采用HE染色觀察組織學(xué)變化；免疫組化染色采用SABC法，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果采用HPIAS-1000彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測定陽性信號(hào)指標(biāo)的平均積分光密度值(IDP)并計(jì)算其均值后分析。單核巨噬細(xì)胞抗原(ED-l)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用每張切片高倍視野(×400)下隨機(jī)選擇10個(gè)腎小球和10個(gè)不重疊腎小管間質(zhì)區(qū)，分別計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球及每個(gè)視野下腎小管間質(zhì)區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其均數(shù)。

腎組織MCP-1及CTGF蛋白表達(dá)采用Western Blotting法檢測。將腎組織加入裂解液中，提取總蛋白后，測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠，蛋白樣本在100℃變性5 min，各取樣本20 μg上樣，進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃恒溫?fù)u床封閉60 min，加入一抗(MCP-1、CTGF及β-actin，1∶100稀釋)、4℃孵育過夜，洗滌后加入二抗(1∶1 000稀釋)于37℃孵育60 min后DAB避光顯色、定影。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶光密度掃描分析，以靶蛋白條帶光密度與內(nèi)參照條帶光密度的比值作為蛋白的各組相對(duì)表達(dá)量，予以統(tǒng)計(jì)分析。

腎組織MCP-1及CTGF核酸表達(dá)采用RT-PCR法檢測。腎皮質(zhì)組織總RNA提取按Trizol說明書進(jìn)行，以3 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以此為模板應(yīng)用PCR試劑加入相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增，CTGF(160 bp)上游5’-AGCTGCCTACCGACTGGAAGA-3’，下游5’-CTTCTCCAGCCTGCAGAAGGT-3’，MCP-1(191 bp)上游5’-CCTGCTGCTACTCATTCAC-3’，下游5’-TCTCACTTGGTTCTGGTCC-3’，內(nèi)參β-actin(650 bp)上游5’-C￣T￣C￣T￣G￣G￣T￣C￣G￣T￣A￣C￣C￣A￣C￣T￣G￣G￣C￣A￣T￣T￣G-3’，下游5’-C￣C￣T￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣C￣A￣T￣C￣T￣G￣C-3’。CTGF反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；95℃變性50s， 61.6℃退火50s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。MCP-1反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；95℃變性50s，56.2℃退火50s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。β-actin反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；95℃變性50s，63.6℃退火50s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠同一個(gè)點(diǎn)樣孔中，100V電壓下電泳后觀察拍照，用凝膠圖像系統(tǒng)成像及進(jìn)行掃描定量分析，以所測得凈光密度與內(nèi)參照凈光密度的比值代表半定量值。

結(jié)　　果

一般情況及血、尿生化指標(biāo)比較大鼠造模成功后出現(xiàn)明顯多飲、多食及多尿癥狀，其中TG1組于干預(yù)期間死亡1只；各組實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量無明顯差異，造模成功后實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量逐漸減輕。各組造模前血糖比較均無統(tǒng)計(jì)意義，造模后血糖均明顯升高達(dá)到造模成功水平，而各干預(yù)組血糖均較NC組升高，各干預(yù)組8周后血糖較治療前有下降，但均高于DN組；造模后各組UTP較NC組明顯升高并達(dá)到DN標(biāo)準(zhǔn)，各干預(yù)組與模后比較均有下降，其中TG2組更明顯(P<0.01)，分析發(fā)現(xiàn)8周后各干預(yù)組UTP較DN組減少(P<0.01)；DN組及干預(yù)組SCr與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義；DN組BUN水平較NC組升高(P<0.01)，而各干預(yù)組較DN組明顯下降(P<0.01)；TG2組Alb水平較NC組升高(P<0.01)，各干預(yù)組較DN組升高(P<0.01)(表1)。

表1　各組大鼠一般情況及實(shí)驗(yàn)室檢查變化情況比較

腎組織病理改變NC組腎小球及腎小管形態(tài)規(guī)則，無明顯病變(圖1A)；DN組見腎小球體積略增大，系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增生，部分腎小管上皮細(xì)胞肥大，呈空泡及顆粒變性(圖1B)，而TG干預(yù)組腎小球及腎小管上述病變有不同程度改善(圖1C、D)。

腎組織CTGF及MCP-1免疫組化及蛋白表達(dá)NC組腎組織各部位無或少量CTGF及MCP-1表達(dá)(圖2A，圖3A)；DN組可見MCP-1在腎小球及腎小管間質(zhì)中有大量表達(dá)，CTGF在腎小球表達(dá)明顯(圖2B，圖3B)；而在TG干預(yù)組其表達(dá)均明顯減少(圖2C、D，圖3C、D)。圖像分析結(jié)果顯示DN組CTGF及MCP-1表達(dá)增加(P<0.01)，與DN組相比，TG1及TG2組表達(dá)明顯減少，其中CTGF在TG2組明顯減少有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；Western Blotting結(jié)果顯示與免疫組化結(jié)果基本相符(圖4，表2)。

圖1　A：NC組腎小球、腎小管形態(tài)規(guī)則，無明顯病變(HE,×400)；B：DN組腎小球稍增大，系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增生，部分腎小管上皮細(xì)胞肥大，呈空泡及顆粒變性(HE,×400)；C：TG1組腎小球系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增生及腎小管上皮細(xì)胞肥大和變性較DN組改善(HE,×400)；D：TG2組腎小球系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增生及腎小管上皮細(xì)胞肥大和變性較DN組改善(HE,×400)

圖2　A：NC組腎小球及腎小管間質(zhì)未見棕褐色物沉積；B：DN組腎小球及腎小管間質(zhì)中有大量棕褐色物沉積，范圍較NC組明顯增多；C：TG1組腎小球及腎小管間質(zhì)中有較多棕褐色物沉積，范圍較DN組減少；D：TG2組腎小球及腎小管間質(zhì)中有少許棕褐色物沉積，范圍較DN組明顯減少(IHC，×400)

圖3　A：NC組腎小球及腎小管間質(zhì)未見棕褐色物沉積；B：DN組腎小球及腎小管間質(zhì)中有大量棕褐色物沉積，范圍較NC組明顯增多；C：TG1組腎小球及腎小管間質(zhì)中有較多棕褐色物沉積，范圍較DN組減少；D：TG2組腎小球及腎小管間質(zhì)中有少許棕褐色物沉積，范圍較DN組明顯減少(IHC，×400)

圖4　各組腎組織CTGF及MCP-1蛋白表達(dá)(Western印跡)

ED-1免疫組化及細(xì)胞計(jì)數(shù)NC組腎小球及腎小管間質(zhì)僅有少量巨噬細(xì)胞浸潤(圖5A)；DN組腎小球內(nèi)及腎小管間質(zhì)浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)顯著高于NC組(P<0.01)(圖5B)；而TG治療組腎小球及腎小管間質(zhì)浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)較DN組明顯減少(圖5C、D)(P<0.01)，其中TG2組較明顯(表2)。

RT-PCR結(jié)果與NC組比較，TG1組及DN組腎CTGF mRNA及MCP-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，各干預(yù)組均較DN表達(dá)明顯下降(P<0.01)，且TG2組較TG1組明顯下降(P<0.01)(表2，圖6)。

圖5　A：NC組腎小球及腎小管間質(zhì)有少量棕褐色物沉積細(xì)胞；B：DN組腎小球內(nèi)及腎小管間質(zhì)見較多棕褐色物沉積細(xì)胞，數(shù)量顯著高于NC組；C：TG1組腎小球及腎小管間質(zhì)有少量棕褐色物沉積細(xì)胞，數(shù)量較DN組減少；D：TG2組腎小球及腎小管間質(zhì)有少量棕褐色物沉積細(xì)胞，數(shù)量較DN組明顯減少(IHC，×400)

表2　各組腎組織CTGF和MCP-1陽性面積、蛋白、核酸表達(dá)及ED-1陽性細(xì)胞數(shù)比較

圖6　各組大鼠腎組織CTGF及MCP-1 mRNA的表達(dá)(RT-PCR)

討　　論

研究已證實(shí)炎癥及免疫反應(yīng)在DN發(fā)生及進(jìn)展中起重要作用[1]。MCP-1是介導(dǎo)腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)的最重要炎癥趨化因子之一，在多種腎臟疾病的發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮作用[4]；浸潤的單核巨噬細(xì)胞可刺激腎固有細(xì)胞活化和增生，一方面促進(jìn)腎內(nèi)局部炎癥損傷，另一方面使Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅳ型膠原等產(chǎn)生增加和集聚，同時(shí)激活黏附分子，誘導(dǎo)溶酶體釋放和活化轉(zhuǎn)化生長因子，促進(jìn)ECM增多，進(jìn)而加劇腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。CTGF屬于即刻早期基因CNN家族的一種細(xì)胞因子，在腎臟中含量最高，研究顯示在DN導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化過程中，CTGF是關(guān)鍵性細(xì)胞因子之一，參與DN的病理過程，是導(dǎo)致糖尿病腎損害的重要原因[5]。觀察發(fā)現(xiàn)DN患者尿MCP-1水平明顯升高，且與腎間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮的程度相一致[6]，也有研究證實(shí)糖尿病患者尿CTGF的含量可作為診斷早期腎損害較敏感的指標(biāo)，其濃度也與DN嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，有助于監(jiān)測、判斷其病程進(jìn)展情況[7,8]。許多研究均顯示DN患者彌漫性腎小球硬化與巨噬細(xì)胞浸潤有關(guān)，系膜細(xì)胞MCP-1及CTGF的表達(dá)參與DN的發(fā)生發(fā)展[7,9]，提示MCP-1及CTGF參與DN的發(fā)病過程，阻斷其表達(dá)將成為DN更有效的治療途徑，可能是治療腎臟纖維化潛在的靶點(diǎn)。本研究也證實(shí)MCP-1及CTGF參與DN大鼠早期腎損害；而巨噬細(xì)胞在MCP-1的趨化作用下進(jìn)入腎小球及腎小管間質(zhì)后分泌促纖維化因子進(jìn)而加重腎間質(zhì)纖維化，這與Wada等[10]的研究基本相符，而本研究也發(fā)現(xiàn)TG干預(yù)可明顯抑制其表達(dá)及巨噬細(xì)胞的浸潤，進(jìn)一步驗(yàn)證了MCP-1及CTGF在DN中的作用。

TG可從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制免疫應(yīng)答過程，抑制系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，延緩腎小球硬化；同時(shí)能顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而減輕腎小管的損傷，對(duì)腎小球足細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用；研究發(fā)現(xiàn)雷公藤提取物如雷公藤甲素能下調(diào)多種刺激因素造成的腎小管上皮細(xì)胞MCP-1的合成增加[11]，TG對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用可能與減少腎臟CTGF表達(dá)相關(guān)[12]；臨床研究也發(fā)現(xiàn)TG可明顯減少DN蛋白尿，延緩腎功能進(jìn)展，療效優(yōu)于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類藥物[13]，但TG在DN的治療機(jī)制仍需深入研究。

有研究表明早期DN炎癥反應(yīng)的重要特征是巨噬細(xì)胞及其相關(guān)炎癥因子在腎小球內(nèi)的浸潤和異常表達(dá)，而巨噬細(xì)胞是TG抗炎作用的主要靶點(diǎn)[14]，本研究亦發(fā)現(xiàn)DN組腎CTGF及MCP-1表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，經(jīng)TG干預(yù)后，腎組織CTGF、MCP-1及巨噬細(xì)胞浸潤較DN組顯著下降，提示TG可能是通過降低CTGF及MCP-1水平，并減輕巨噬細(xì)胞的浸潤從而使腎臟病理改變及腎功能損害得到緩解，從而發(fā)揮其良好的腎臟保護(hù)作用。研究進(jìn)一步表明，TG可抑制早期DN大鼠MCP-1及CTGF異常表達(dá)，推測TG很可能主要是通過抑制巨噬細(xì)胞聚集及阻斷炎癥因子激活的抗炎作用而達(dá)到改善腎小球損傷的。研究也發(fā)現(xiàn)雙倍劑量TG抑制CTGF及MCP-1表達(dá)更顯著，其中對(duì)CTGF的抑制表達(dá)更明顯，提示TG改善腎損害的作用可能與劑量有關(guān)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)干預(yù)后SCr、BUN較DN組均有減低，BUN最為明顯，且干預(yù)后Alb、UTP均有改善，其中TG2組更明顯，說明TG在降低BUN、尿蛋白及改善營養(yǎng)狀態(tài)方面有一定作用且與劑量有關(guān)；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DN組及干預(yù)組大鼠在造模后血糖均顯著高于對(duì)照組；而干預(yù)后血糖均有所下降，但均處于高值且均高于DN組，提示該藥并不能通過降低血糖而治療DN；研究還發(fā)現(xiàn)雙倍劑量TG對(duì)大鼠血脂影響較大，特別是總膽固醇及三酰甘油明顯升高，此與相關(guān)研究不甚符合[15]，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，但也提醒臨床治療過程中除注意TG傳統(tǒng)的不良反應(yīng)外，還需要注意控制血脂代謝紊亂情況。

綜上所述，本研究提示在早期DN大鼠模型中TG對(duì)緩解腎臟損害、保護(hù)腎臟有一定效果，可能與其下調(diào)MCP-1及CTGF的表達(dá)有關(guān)，且雙倍劑量TG效果更為明顯，進(jìn)一步為TG在臨床治療DN中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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