楊曉博，閆衛(wèi)平，楊　飛，竇偉峰

(1．許昌學院電氣信息工程學院，河南許昌　461000；2．大連理工大學電子科學與技術學院，遼寧大連　116024)

0　引言

毛細管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)芯片是微流控生物芯片的一種，廣泛應用于蛋白質(zhì)組分研究、藥物篩選、基因診斷等生化分析領域[1]。陣列CE芯片由于能夠同時對多種分析樣品進行并行檢測，效率更高、成本更低，已成為生化分析領域前沿的研究熱點之一[2]。在利用CE芯片進行生化分析的過程中，被測樣品的組分及含量等相關信息由檢測系統(tǒng)來測定。由于CE芯片中毛細管的內(nèi)徑一般為10～100 μm，樣品進樣量極少，因而對檢測系統(tǒng)的靈敏度、分辨率及響應速度都有較高的要求，檢測系統(tǒng)的性能將直接決定CE芯片分析系統(tǒng)的整體性能[3]。

電荷耦合器件(Charge Coupled Device，CCD)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種新型半導體集成光電器件。它具有噪聲低、響應光譜寬、精度和靈敏度高、可靠性好等優(yōu)點。近幾十年來，CCD器件及其應用技術的研究取得了飛速發(fā)展，在圖像傳感和非接觸測量領域的發(fā)展尤其迅速[4]。針對傳統(tǒng)CE芯片熒光檢測系統(tǒng)功耗高、體積龐大、噪聲難于消除等問題，設計采用CCD作為光電轉(zhuǎn)換器件，搭建出陣列CE芯片熒光檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)了對多個CE通道熒光信號的同時檢測和顯示。

1　檢測系統(tǒng)組成及其工作原理

基于CCD的陣列CE芯片檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示，它主要由綠色LED光源、光路系統(tǒng)、光電轉(zhuǎn)換器件CCD和信號處理系統(tǒng)組成。其工作原理為：綠色LED光源發(fā)出的綠光(峰值波長為532 nm)照射至陣列CE芯片分離通道內(nèi)的熒光染料樣品(Rhodamine B)時，樣品會在激發(fā)光的照射下發(fā)出橘紅色熒光信號(峰值波長為580 nm)；由于CE芯片采用的是玻璃材料，不可避免的在其表面會產(chǎn)生光的反射和折射現(xiàn)象，發(fā)射光與折射光都屬于與熒光信號無關的背景噪聲，因此需要通過濾光片將其濾除掉；熒光信號經(jīng)過黑色膠片上的針孔聚焦后傳輸至光電轉(zhuǎn)換器件CCD，CCD將檢測到的熒光信號轉(zhuǎn)換為模擬信號，再通過數(shù)據(jù)采集卡上集成的高速A/D轉(zhuǎn)換模塊，最后經(jīng)USB總線發(fā)送到上位機進行實時顯示，根據(jù)熒光圖譜的峰值即可判斷樣品的含量。

圖1　基于CCD的陣列毛細管電泳芯片檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

2　CCD芯片及其驅(qū)動電路設計

系統(tǒng)中使用的CCD芯片為TCD1304AP芯片。其內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖2所示，主要包括光敏單元(由光電二極管和電荷轉(zhuǎn)移電極組成，含復位脈沖)、移位寄存器(2個)、轉(zhuǎn)移柵電極(2個)、內(nèi)部驅(qū)動信號邏輯電路、輸出信號緩沖電路[5]。其中，感光區(qū)位于CCD的中央，光敏陣列由光電二極管組成；感光單元中前面32個及后面的14個稱為啞元，沒有信號輸出，用Dn表示；中間的3 648個像素單元是有效的感光單元，用Sn表示。每個光敏單元的大小為8 μm × 200 μm．內(nèi)部CCD驅(qū)動電路由脈沖產(chǎn)生電路和CCD驅(qū)動器組成，驅(qū)動時鐘頻率為0.8～4 MHz，時序驅(qū)動要求開啟電子快門功能的最短光積分時間為10 μs．

圖2　TCD1304AP CCD芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖

2．1CCD芯片驅(qū)動原理

CCD芯片內(nèi)部感光區(qū)兩側(cè)分別是2個復位脈沖電極和轉(zhuǎn)移柵電極；最外層是模擬位移寄存器，它由一系列的MOS電容器組成。模擬寄存器負責接收、存儲和轉(zhuǎn)移光電二極管產(chǎn)生的電荷包，其中電荷包的轉(zhuǎn)移受控于轉(zhuǎn)移柵電極的作用。

光敏單元在光照作用下獲得光生載流子從而形成電荷包，電荷包在轉(zhuǎn)移脈沖信號SH的作用下將會按奇偶序號分開并被轉(zhuǎn)移至兩側(cè)的移位寄存器中。電荷包通過奇偶分離的方式后轉(zhuǎn)移速度會得以提高，而當外部驅(qū)動電路對ΦM、ICG、SH信號提供合適的脈沖信號時，模擬移位寄存器中的電荷包將由右向左順次進行轉(zhuǎn)移，這就是外圍驅(qū)動電路對CCD進行驅(qū)動的原理。

為保證檢測系統(tǒng)的精確度、測量速度及抗干擾能力，需要解決2個主要問題：為CCD提供正常工作時所需要的時序驅(qū)動信號；對CCD輸出信號的處理。因此，CCD驅(qū)動電路設計包括電源電路設計、時序驅(qū)動電路設計及輸出信號調(diào)整電路設計。此外，還設計了4個光積分時間控制輸入端口，用以對CCD芯片光積分時間進行控制。

2．2CCD驅(qū)動電源電路

5 V電源電路原理如圖3所示，它的工作原理為：1個周期開始時，芯片OUTP引腳被置低，打開與其相連的P溝道場效應管Q2，電流從輸入端流經(jīng)檢測電阻、MOS場效應管及電感線圈流到輸出端，電流幅度將增大并且受控于電感線圈；落在檢測電阻R1上的電壓在芯片內(nèi)部放大，經(jīng)過內(nèi)部補償后穩(wěn)定在1個區(qū)間內(nèi)，補償后的信號將與誤差放大器的輸出進行比較，當此信號與誤差電壓相等時，P溝道場效應管被截止；電感中的電流將通過二極管D在LC回路中振蕩，與此同時，N溝道場效應管被打開，MOS場效應管的電壓降小于二極管上的正向電壓降，這使得轉(zhuǎn)換器的效率得以提高；在1個周期的最后，N溝道場效應管在控制器的控制下關閉，新的周期循環(huán)開始，如此往復，使得電源電路輸出持續(xù)穩(wěn)定的電壓。

2．3CCD時序驅(qū)動電路

CCD驅(qū)動模塊的邏輯連接如圖4所示。其中，CCD驅(qū)動模塊的輸入端有系統(tǒng)時鐘輸入clkin、復位信號reset、光積分時間調(diào)整輸入端M1～M4；輸出信號端有復位脈沖ICG、幀轉(zhuǎn)移信號SH、CCD驅(qū)動時鐘Mclk、像元同步信號SP及行同步信號FC.另外，F(xiàn)PGA芯片的所有輸入、輸出端口均通過TC74HC04芯片與外界相連。該芯片是一種高速的CMOS反相器，其轉(zhuǎn)換速度可以與LSTTL電路相媲美，具有高噪聲限和輸出穩(wěn)定的特性，所有的輸入端都有電流保護裝置。

圖4　CCD驅(qū)動模塊邏輯連接圖

2．4CCD輸出電壓調(diào)整電路

CCD輸出電壓調(diào)整電路如圖5所示。其中，電容C7～C9為濾波電容，用以濾除電源或輸出端的高頻干擾；放大器采用AD8031電壓反饋式軌對軌放大器，其正向輸入端為電壓補償電路，VCC經(jīng)過R9和R10分壓后的電壓V+補償?shù)椒糯笃鞯恼蜉斎攵艘蕴岣咻敵龆说碾妷?；反向端?gòu)成1個電壓負反饋電路，起到放大CCD的OS端輸出電壓VOS的作用；通過調(diào)整可變電阻器R10和R5的值可以使輸出電壓VO的值滿足后續(xù)A/D轉(zhuǎn)換芯片的滿量程要求，進而提高CCD采集數(shù)據(jù)的精度和測量范圍。

圖5　CCD輸出電壓調(diào)整電路

2．5CCD積分時間控制電路

CCD驅(qū)動模塊有4個輸入端(M1～M4)，用來控制CCD的積分時間，其控制信號來自CY7C68013的PC0～PC3端口。當MCU接收到上位機的設置積分時間指令后，先讀出配置參數(shù)，然后對PC端口的低四位進行配置，經(jīng)過如圖6所示的電路后到達CCD驅(qū)動器的M1～M4端口，起到控制積分時間的作用[6]。由圖中可以看出，當PCx口置高時，三極管被導通，Mx被置低；反之則被置高，即PCx端口和Mx端口邏輯反相。例如，若要分配積分時間最長，即{M1，M2，M3，M4}為{1，1，1，1}，則將PC0～PC3口全部置零即可。

圖6　CCD積分時間控制電路

3　系統(tǒng)軟件設計

系統(tǒng)硬件環(huán)境的搭建是功能實現(xiàn)的基礎，而系統(tǒng)軟件的設計則是系統(tǒng)功能實現(xiàn)的具體過程。根據(jù)系統(tǒng)的具體功能，軟件的設計主要包括兩部分：上位機程序，包括PC機端USB設備的驅(qū)動及相應的檢測控制程序；下位機程序，包括8051增強型單片機固件程序及保證芯片F(xiàn)X2模塊工作在Slave FIFO模式下的FPGA實現(xiàn)。

USB驅(qū)動程序開發(fā)采用Windows Driver Module模式，即Windows驅(qū)動程序模式。它的實現(xiàn)過程是在Visual C++ 6．0的編程環(huán)境下，利用Driver Studio自帶的Driver Wizard產(chǎn)生設備驅(qū)動程序框架，進而完成系統(tǒng)所需的USB驅(qū)動程序。固件編程即為USB外設所編寫的單片機程序，主要完成以下工作：USB芯片內(nèi)嵌的增強型8051單片機接收并識別出上位機發(fā)送的命令，比如開啟CCD、設置CCD參數(shù)、數(shù)據(jù)采集等命令，然后執(zhí)行相應的操作。程序采用C語言開發(fā)，使用Keil C進行編譯和調(diào)試。下位機軟件的流程圖如圖7所示。

圖7　下位機軟件流程圖

軟件設計使用FPGA芯片將FX2模塊配置為Slave FIFO模式進行數(shù)據(jù)采集，并通過USB接口傳輸至上位機。

FPGA程序設計使用Verilog HDL語言實現(xiàn)，在QUARTUS II 9．0平臺上完成程序的綜合、實現(xiàn)及下載，同時使用ModelSim軟件進行仿真。通過對CCD驅(qū)動輸入信號時序要求的分析可知，CCD的像元同步信號和行同步信號需作為輸出信號，以便于對后續(xù)A/D轉(zhuǎn)換進行同步。

4　測試結(jié)果及分析

4．1CE芯片結(jié)構(gòu)

檢測系統(tǒng)中使用的四通道陣列毛細管電泳芯片結(jié)構(gòu)如圖8所示。芯片通道單元結(jié)構(gòu)為基本的十字構(gòu)型，其中進樣通道長10 mm，分離通道長40 mm，檢測點與十字交叉點處的距離為30 mm，相鄰兩分離通道間距離為6 mm；通道深60 μm，寬100 μm(深40 μm處)，儲液池直徑為2 mm，容積約為5 μL；整個芯片尺寸為40 mm × 80 mm．此外，設計的支撐網(wǎng)格起到更有效封接基片和蓋片的作用。

圖8　四通道陣列毛細管電泳芯片結(jié)構(gòu)示意圖

4．2芯片電泳分離操作

每次電泳實驗前，依次使用1 mol/L(M)的NaOH溶液、去離子水(18 MΩ)和tris-borate-EDTA (2 × TBE，pH 8.3)緩沖溶液清洗CE芯片微通道。實驗過程中采用電動進樣模式進行熒光染料Rhodamine B樣品的進樣。進行電泳操作前，首先取適量Rhodamine B儲備液稀釋在無水乙醇中配制成一定濃度的樣品溶液，接著將緩沖液和樣品加入各自的儲液池中。進樣階段，樣品從S(600 V)遷移至SW，B和BW電極電壓分別為400 V和600 V，SW電極懸浮。進樣20 s后，高壓電源切換，樣品帶從B(800 V)遷移至BW進行分離并檢測。此時，S和SW電極電壓均為600 V，BW電極懸浮(S、SW、B、BW見圖1)。每次電泳操作結(jié)束后，立即用去離子水清洗芯片微通道，以免緩沖溶液水分蒸發(fā)引起毛細管通道堵塞。

4．3樣品電泳分離結(jié)果

為驗證設計出的陣列CE芯片熒光檢測系統(tǒng)的性能，將CE芯片的4個分離通道中依次注入4種不同濃度的Rhodamine B樣品溶液進行電泳分離，其濃度依次為1.0×10-6M，1.0×10-5M，1.0×10-4M，1.0×10-3M．得到的電泳分離譜圖如圖9所示，由圖可以看出，4個熒光信號的峰值由左至右依次增高，它與4個毛細管電泳通道中注入的樣品溶液濃度依次增大相對應，濃度越大，峰值越高。

圖9　四通道毛細管電泳芯片注入不同濃度樣品時的電泳分離譜圖

5　結(jié)束語

設計出的基于CCD的陣列CE芯片熒光檢測系統(tǒng)使用綠色LED光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的半導體泵浦固體激光器；采用線陣高靈敏度的CCD作為熒光信號檢測器件，實現(xiàn)了同一檢測視野范圍內(nèi)多個通道的同時檢測，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、成本低、具有較高的信噪比和靈敏度。

參考文獻：

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[6]翟晶晶．基于電子快門自動增益的CCD驅(qū)動電路研究．現(xiàn)代電子技術，2010(19)：188-190．