張明，王鐵軍，劉書茂，黃東明，李輝，高飛，李悅，杜堯

(1.北京市大興區(qū)人民醫(yī)院骨科，北京 102600；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究室，湖南 長沙 410011)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。其主要病變特征是細(xì)胞外基質(zhì)合成不足導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變、繼發(fā)的骨贅形成和累及滑膜。女性的發(fā)病率高于男性。其發(fā)生率隨年齡的增長而升高，據(jù)統(tǒng)計我國50 歲以上人口發(fā)病率為5%，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為9.56%；60 歲以上人口發(fā)病率為20%，其中膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率占49%[1]。其發(fā)病機制與多種因素相關(guān)，但尚無確切的機制。我們前期的研究結(jié)果表明骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液中微小RNA-140(micro RNA-140，miR-140)的表達(dá)是下調(diào)的，且與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[2]。本研究旨在檢測玻璃酸鈉注射液治療骨關(guān)節(jié)炎前后miR-140的表達(dá)、膝關(guān)節(jié)HSS評分變化，探討miR-140在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 患者 按照美國風(fēng)濕病學(xué)會(American rheumatism association，ARA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，選取不同Kellgren-Lawrence分級骨關(guān)節(jié)炎患者，Ⅰ級組治療前后各10 例、Ⅱ級組治療前后各10 例、Ⅲ級組治療前后各10 例、Ⅳ級組治療前后各10 例，最小年齡38 歲，最大年齡90 歲，平均年齡62.1 歲，男性15 例，女性25 例。所有實驗對象均來自于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究室，行玻璃酸鈉膝關(guān)節(jié)腔注射治療，治療前抽取關(guān)節(jié)液，一次2 mL，1周1次，5周一療程，治療后1周抽取關(guān)節(jié)液，置于15 mL無菌、無酶的離心管中備用。同時對每個患者治療前后行HSS評分。本研究方案得到了中南大學(xué)倫理學(xué)委員會認(rèn)可，全部標(biāo)本收集于2010年6月至2010年12月。

1.2 材料 玻璃酸鈉注射液(施沛特)為山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司提供。PCR熱循環(huán)儀購自美國Applied Biosystems公司(型號：2700)；實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司(型號：StepOneTM)。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購自美國Applied Biosystems公司。TaqMan MicroRNA Assays試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ(no UNG)購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法 采用HSS膝關(guān)節(jié)功能評分表對所有研究對象進(jìn)行評分。采用Trizol一步法提取Total-RNA(裂解、分層、RNA沉淀、RNA洗滌和RNA溶解)。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系見表1，反應(yīng)條件(16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min)，選擇OD260/280值在1.6～2.1之間的Total-RNA標(biāo)本，每次反應(yīng)Total-RNA量為100 ng。實時熒光定量PCR檢測miR-140和U6snRNA，反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件(95℃ 10 min，95℃ 15 s及60℃ 1 min)，后2步共50個循環(huán)。在相對定量分析中，熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示。用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)量[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。治療前后的樣本PCR檢測結(jié)果應(yīng)用獨立樣本配對t檢驗進(jìn)行分析，組間比較采用ANOVA方差分析，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。OA嚴(yán)重程度與治療前后miR-140表達(dá)水平變化之間的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)秩檢驗。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系成分及體積

表2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系的成分及體積

2 結(jié) 果

2.1 治療前后HSS評分、miR-140表達(dá)水平結(jié)果 與治療前相比，HSS評分升高，miR-140在骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液中的表達(dá)水平上調(diào)。Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組治療前后HSS評分、miR-140表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Ⅳ級組治療前后HSS評分、miR-140表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1～2)。

圖1 治療前后HSS評分比較

2.2 組間比較及相關(guān)性分析 Ⅳ級組HSS評分、miR-140的表達(dá)改變與Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；骨關(guān)節(jié)炎的不同分級與miR-140的表達(dá)改變呈負(fù)相關(guān)(r=-0.825，P<0.05)。

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎又稱退行性關(guān)節(jié)炎，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制尚不清楚，可能與高齡、女性、肥胖、職業(yè)性過度使用等因素有關(guān)；繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎與代謝異常、機械性或解剖學(xué)異常、內(nèi)分泌異常、炎癥性關(guān)節(jié)疾患、神經(jīng)性缺陷等因素有關(guān)。OA的主要臨床特點是：關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形、功能受限，好發(fā)于膝關(guān)節(jié)，很難逆轉(zhuǎn)，治療困難。病理特征：a)關(guān)節(jié)軟骨軟化，彈性降低，纖維變性，可有碎裂、剝脫、軟骨下骨質(zhì)外露；b)滑膜大量增殖、水腫；c)軟骨下骨增生，骨小梁增粗；d)關(guān)節(jié)囊可發(fā)生纖維變性和增厚，限制關(guān)節(jié)活動，周圍肌肉發(fā)生保護性痙攣，出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。其發(fā)病機制迄今為止尚不完全清楚，可能是多種因素共同作用的結(jié)果。OA嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，給社會及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，所以研究其發(fā)病機制及有效的治療方法具有十分重要的價值。

圖2 治療前后miR-140相對表達(dá)量的比較

玻璃酸是一種線形酸性粘多糖，由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸二糖單位反復(fù)聯(lián)接組成，在關(guān)節(jié)內(nèi)由滑膜B細(xì)胞分泌，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)內(nèi)的重要成分[5]。玻璃酸鈉的主要生理功能有：a)參與細(xì)胞外液中電解質(zhì)和水分的調(diào)節(jié)；b)關(guān)節(jié)和細(xì)胞間潤滑作用；c)與蛋白糖亞單位結(jié)合構(gòu)成蛋白多糖聚合物，組成軟骨基質(zhì)；d)透明質(zhì)酸鈉還可通過修復(fù)生理屏障、分子篩作用、促進(jìn)自身玻璃酸鈉合成、穩(wěn)定痛覺感受等作用治療OA。玻璃酸鈉能增強關(guān)節(jié)液粘稠性和潤滑功能，進(jìn)入軟骨基質(zhì)與糖蛋白結(jié)合，促進(jìn)軟骨愈合和再生；改善滑液組織的炎癥反應(yīng)，降低血清與滑膜液中IL-1、IL-6水平，抑制免疫損害進(jìn)程并緩解疼痛[6]。1974年，Peyron和Balazs首次用玻璃酸鈉治療26 例OA患者，取得了良好的效果[7]。進(jìn)入21世紀(jì)以來，國內(nèi)、外大量研究證實玻璃酸鈉對膝OA的近期及遠(yuǎn)期療效是肯定的，2000年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)把玻璃酸鈉寫入髖、膝OA治療指南[8]。玻璃酸鈉治療OA，能夠向患者補充外源性的玻璃酸鈉，提高關(guān)節(jié)液內(nèi)玻璃酸鈉的含量，使軟骨表面形成自然屏障，減輕或消除了關(guān)節(jié)的摩擦，改善了滑膜的生物學(xué)功能，恢復(fù)和穩(wěn)定關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境，重建膝OA關(guān)節(jié)內(nèi)已被打亂的平衡系統(tǒng)[9]。本研究表明玻璃酸鈉治療輕、中度膝OA療效明顯，而對重度膝OA療效不明顯。

miRNA是一類內(nèi)生的小RNA，長度約19～25個核苷酸組成，是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，大約有70～90個堿基對，由前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。它們不參與蛋白質(zhì)的編碼，但是可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，一個miRNA可以調(diào)控多個基因的表達(dá)，幾個miRNAs也可以共同精細(xì)調(diào)控一個基因的表達(dá)。MiR-140是micRNAs家族中的成員之一。2006年Tuddenham等[10]通過小鼠胚胎研究miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中的作用，實驗方法包括DNA的構(gòu)建、原位雜交、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、熒光素酶分析，結(jié)果顯示小鼠胚胎發(fā)育過程中miR-140在很多軟骨組織(如顱骨、四肢骨、肋骨、胸骨的軟骨部分)當(dāng)中特異性表達(dá)，并且證明miR-140潛在的靶基因是組蛋白去乙?；?4。2007年Johann等[11]研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚腭的發(fā)育過程中，miR-140基因可以負(fù)性調(diào)節(jié)血小板衍生生長因子(Platelet Derived Growth Factor，簡稱Pdgf)信號途徑，在Pdgf受體蛋白水平，Pdgf受體當(dāng)中包含負(fù)性調(diào)節(jié)作用的miR-140結(jié)合位點，表明miR-140與軟骨的發(fā)育有關(guān)。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140具有軟骨細(xì)胞分化相關(guān)的表達(dá)模型，miR-140在軟骨發(fā)育和體內(nèi)平衡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2010年Miyaki等[12]通過敲除miR-140目標(biāo)基因，建立老鼠動物實驗?zāi)Ｐ停芯拷Y(jié)果顯示miR-140可以調(diào)節(jié)軟骨的發(fā)育，miR-140缺失導(dǎo)致了蛋白多糖的丟失和關(guān)節(jié)軟骨的纖維化，符合年齡相關(guān)的OA樣改變。我們研究小組在2011年采用實時熒光定量的PCR檢測miR-140，研究表明人膝關(guān)節(jié)液中有miR-140表達(dá)，在OA患者表達(dá)是下調(diào)的，且與OA嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[2]。

本研究證實玻璃酸鈉治療OA是有效的，同時miR-140表達(dá)與治療前相比是上調(diào)的，且與OA嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。說明miR-140可能在OA的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。為進(jìn)一步研究miR-140在OA發(fā)病機制中的作用奠定理論基礎(chǔ)。通過本研究尚未確定OA與miR-140之間的因果關(guān)系，在我們后續(xù)研究中需要通過動物實驗、下游靶基因調(diào)控進(jìn)一步證實。

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