張保國

外周血CD4＋T細胞和CD8＋T細胞亞群與胃癌的相關(guān)研究

張保國

目的探討Ⅳ期胃癌患者外周血CD4＋T細胞和CD8＋T細胞表達狀態(tài)與疾病臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。方法采用流式細胞技術(shù)檢測40例胃癌患者外周血CD4＋T細胞和CD8＋T細胞數(shù)目及二者之間的比值；收集胃癌患者臨床病理資料并進行隨訪，分析CD4＋T和CD8＋T表達狀態(tài)與臨床病理特征及無疾病進展生存時間（PFS）之間的關(guān)系。結(jié)果CD4＋T細胞與胃癌患者年齡、腫瘤分化程度、KPS評分及PFS無明顯相關(guān)性，與性別有相關(guān)性（P＜0.05）。CD8＋T細胞與性別、腫瘤分化程度有相關(guān)性（P＜0.05），與年齡、Karnofsky功能狀態(tài)評分（KPS評分）、PFS無明顯相關(guān)性。CD4＋／CD8＋比值與性別、年齡、腫瘤分化程度均無相關(guān)性，與KPS評分顯著相關(guān)（P＜0.05）。生存分析發(fā)現(xiàn)，CD4＋／CD8＋比值與PFS有明顯相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論CD4＋T細胞和CD8＋T細胞在胃癌抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，檢測其比值對于判斷胃癌的預(yù)后具有一定價值。

CD4＋T細胞；CD8＋T細胞；胃癌；預(yù)后

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。機體免疫功能抑制和免疫狀態(tài)異常是介導腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。Ho等［1］認為在機體免疫失衡狀態(tài)下，腫瘤細胞可以逃避免疫細胞的監(jiān)控，發(fā)生免疫逃逸，進而導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展。T細胞亞群是抗腫瘤免疫中重要的一類淋巴細胞［2］，主要包括CD4＋T細胞與CD8＋T細胞。CD4＋T細胞作為輔助性T細胞能產(chǎn)生淋巴因子，增強CD8＋T細胞殺傷腫瘤細胞功能，具有輔助細胞免疫和體液免疫應(yīng)答作用，CD8＋T細胞作為抑制性T細胞和細胞毒性T細胞，是重要的效應(yīng)細胞，二者之間的平衡維持著機體正常的免疫應(yīng)答［3?4］。本研究通過流式細胞技術(shù)檢測Ⅳ期胃癌患者外周血中CD4＋T細胞和CD8＋T細胞的表達情況，分析其與一系列臨床指標之間的相關(guān)性及與患者預(yù)后之間的關(guān)系，為臨床診療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 研究對象均來自南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院腫瘤內(nèi)科。所有對象為2010年12月至2012年12月期間住院的Ⅳ期胃癌患者，接受晚期一線化療，共40例。其中男30例，女10例，年齡25～85歲，中位年齡64歲。對所有患者均進行Karnofsky功能狀態(tài)評分（KPS評分）［5］。所有患者均在化療前2 d清晨抽取空腹血檢測。所有研究對象在近期內(nèi)均無急、慢性細菌性感染及病毒性感染，均無自身免疫性疾病或使用過免疫抑制劑。所有患者隨訪至2013年3月，隨訪內(nèi)容包括腫瘤指標、CT、胃鏡等。

1.2 試驗方法 所有研究對象均于化療前2 d抽取清晨空腹靜脈血2ml，肝素抗凝。取50μl抗凝血于流式專用試管中，加入Beckman Coulter公司提供的CD45 FITC（異硫氰酸熒光素）、CD4 RD1（藻紅蛋白）、CD8 ECD（藻紅蛋白?德州紅?X）、CD3 PC5（藻紅蛋白?花青苷5）四標記單克隆熒光抗體20μl，混勻，室溫避光反應(yīng)20min，加入500μl紅細胞裂解液，溶解紅細胞5～10 min，1000×g離心5min，棄上清，再加入1ml PBS，1000× g離心5min，棄上清，補足500μl磷酸鹽緩沖液，混勻后上Beckman Coulter公司CYTOMICS FC500型流式細胞儀檢測并使用CXP軟件獲取10 000個細胞，以SSC（側(cè)向角散射）／CD45設(shè)門，記錄輔助／誘導T淋巴細胞（CD45＋CD3＋CD4＋CD8－）、抑制／細胞毒性T淋巴細胞（CD45＋CD3＋CD4－CD8＋）百分數(shù)并計算輔助／抑制T淋巴細胞比值（CD4＋／CD8＋）。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示。組間數(shù)據(jù)分析采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，生存分析采用Kaplan?Meier分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者外周血CD4＋細胞、CD8＋細胞的表達狀態(tài) 40例胃癌患者外周血CD4＋T值為33.41±10.30，CD8＋T值為27.51±10.59，CD4＋／CD8＋在正常范圍內(nèi)的均值為1.33±0.30，CD4＋／CD8＋異常的均值為1.67 ±1.30。

2.2 CD4＋T細胞、CD8＋T細胞與臨床參數(shù)之間的關(guān)系 CD4＋T細胞計數(shù)與年齡、分化程度、KPS評分無關(guān)，與性別相關(guān)（P＜0.05），女性患者CD4＋T細胞較男性患者高；CD8＋T細胞與性別、分化相關(guān)（P＜0.05），男性患者CD8＋T細胞較女性患者高；分化程度越差，CD8＋T細胞越低。CD4＋／CD8＋與性別、年齡、分化程度均無相關(guān)性，而與KPS評分相關(guān)（P＝0.039），KPS評分越高，CD4＋／CD8＋在正常范圍內(nèi)的比例越高。見表1。

表1 CD4＋T細胞、CD8＋T細胞與臨床參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 各臨床參數(shù)與患者生存期之間的關(guān)系 采用Kaplan?Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，CD4＋／CD8＋比值與PFS有明顯相關(guān)性，CD4＋／CD8＋比值在正常范圍內(nèi)的患者PFS顯著高于異常者（P＝0.012）（圖1）。而性別、年齡、分化程度、KPS評分、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞與PFS無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

胃癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，居全世界惡性腫瘤死因第4位，我國是胃癌高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率遠超世界的平均水平。機體的免疫狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］，當機體的免疫功能受到抑制，腫瘤的生長速度明顯增快，快速發(fā)展的腫瘤又反饋性加劇機體免疫功能的破壞。T細胞是抗癌免疫的核心細胞，包括CD4＋T細胞、CD8＋T細胞。CD4＋T細胞不僅可以分泌大量的細胞因子輔助CD8＋T細胞殺傷腫瘤細胞，而且在腫瘤免疫中具有免疫記憶和直接殺傷腫瘤細胞功能，CD8＋T細胞除行使殺傷效應(yīng)外，亦具有強烈的調(diào)節(jié)效應(yīng)［7?8］。惡性腫瘤患者多數(shù)處于免疫抑制狀態(tài)，由于免疫功能下降而出現(xiàn)T細胞亞群的紊亂，其中主要一個表現(xiàn)就是CD4＋／CD8＋比值異常。

圖1 CD4＋／CD8＋與胃癌患者PFS的關(guān)系

CD4＋T細胞并不是一種單一的淋巴細胞，而是一系列具有不同功能的細胞群。近年來，隨著對CD4＋T細胞研究的深入，目前已經(jīng)證實活化的CD4＋T細胞可以分為CD4＋的輔助性T細胞和CD4＋CD25＋的調(diào)節(jié)性／抑制性T細胞（regulatory／suppressor T cell）兩大類。其中，輔助性T細胞主要包括Th1、Th2和Th17。這些不同的亞群具有抗腫瘤或抑制免疫反應(yīng)，促進腫瘤生長等截然相反的功能［9］。長期以來，人們認為Th1和Th2細胞具有抗腫瘤免疫功能。作為輔助性T細胞，CD4＋T細胞通過分泌干擾素（IFN）等細胞因子和CD8＋T細胞共刺激分子輔助細胞毒T細胞特異性殺傷腫瘤細胞。近來，Muranski等［10］已經(jīng)證實Th17細胞同樣具有抗腫瘤效應(yīng)。CD4＋CD25＋Treg細胞具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特點。其免疫無能性表現(xiàn)在接受抗原刺激后既不增生也無白介素?2分泌等T細胞活化的現(xiàn)象；免疫抑制性是指其自身活化后能夠抑制T淋巴細胞的活化和增殖，進而抑制機體的免疫功能。以往多項研究表明，CD4＋CD25＋Treg細胞在多種惡性腫瘤，如肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌等患者體內(nèi)存在增高的現(xiàn)象，而且增高水平與腫瘤分期晚、病程進展快及預(yù)后差具有顯著相關(guān)性［11?12］。CD8＋T細胞又叫CD8＋的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，CTL），通過穿孔素／顆粒酶途徑和Fas／FasL途徑能夠高效、特異性地殺傷靶細胞，而不損害正常組織［13］。然而，CTL細胞的活化部分依賴于Th細胞，二者的平衡在維持機體免疫功能中發(fā)揮著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，CD4＋／CD8＋比值在正常范圍內(nèi)的患者PSF較CD4＋／CD8＋比值異常者延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.012），而將CD4＋T、CD8＋T細胞分別進行生存分析時卻得到陰性結(jié)果。Shah等［14］在宮頸癌的研究中也得出相似結(jié)果，進一步證實以上2種T細胞介導的免疫功能在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。這表明機體的免疫狀態(tài)不是由單一的一類細胞調(diào)控，只有各類免疫細胞維持在一定穩(wěn)態(tài)時才能發(fā)揮最佳的免疫功能。

本研究結(jié)果還顯示CD8＋T細胞與腫瘤分化程度具有相關(guān)性（P＝0.03），腫瘤分化越差，CD8＋T值越低。CD8＋T具有特異性直接殺傷腫瘤細胞的作用，分化越差的腫瘤往往惡性程度越高，越容易產(chǎn)生免疫耐受，導致CD8＋T細胞表達降低。另外，KPS評分與CD4＋／CD8＋比值相關(guān)，評分越高，CD4＋／CD8＋比值在正常范圍內(nèi)的例數(shù)越多。KPS評分即功能狀態(tài)評分標準，是用來判斷患者臨床狀態(tài)的一種指標，評分越高，健康狀態(tài)越好。本研究結(jié)果顯示，KPS評分高的患者抗腫瘤免疫越強。薛鋒杰等［15］研究68例乳腺癌患者免疫狀態(tài)與生存質(zhì)量之間的關(guān)系，也得到了相同的結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示，CD4＋T細胞、CD8＋T細胞數(shù)與性別有相關(guān)性，女性患者比男性患者CD4＋T細胞數(shù)高，而CD8＋T細胞數(shù)卻相對較低，由于本研究樣本量較小，結(jié)果可能具有偶然性，需要擴大樣本量進一步研究。

綜上所述，晚期胃癌外周血CD4＋／CD8＋比值與患者臨床生存質(zhì)量及預(yù)后密切相關(guān)，但是本研究樣本量小，技術(shù)路線相對簡單，需進一步擴大樣本量來證實CD4＋／CD8＋比值是否可成為胃癌預(yù)后指標和免疫治療靶標。

［1］ Ho PP，Steinman L.The aryl hydrocarbon receptor：a regula?tor of Th17 and Treg cell development in disease［J］.Cell Res，2008，18（6）：605?608.

［2］ Winter H，van den Engel NK，Ruttinger D，etal.Therapeu?tic T cells induce tumor?directed chemotaxis of innate immune cells through tumor?specific secretion of chemokines and stimulation of B16BL6 melanoma to secrete chemokines［J］.JTransl Med，2007，5：56.

［3］ 韓曉紅，石遠凱，馮奉儀，等.流式細胞術(shù)腫瘤患者免疫功能變化［J］.實用腫瘤雜志，1999，14（5）：273?275.

［4］ 張宏偉，吳昊.外周血T細胞研究進展［J］.北京醫(yī)學，2006，28（2）：108?109.

［5］ 張慧榮，姜宏寧，余敏，等.替吉奧治療老年晚期胃腸道腫瘤的臨床觀察［J］.實用老年醫(yī)學，2013，27（8）：663?665.

［6］ Ren Z，Pang G，Clancy R，et al.Shift of the gastric T?cell re?sponse in gastric carcinoma［J］.J Gastroenterol Hepatol，2001，16（2）：142?148.

［7］ Kawamoto K，Nakamura S，Iwashita A，et al.Clinicopatholo?gical characteristics of primary gastric T?cell lymphoma［J］. Histopathology，2009，55（6）：641?653.

［8］ Ichihara F，Kono K，Takahashi A，et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheralblood and tumor?infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers［J］.Clin Cancer Res，2003，9（12）：4404?4408.

［9］ Hu HM，Winter H，Urba WJ，et al.Divergent roles for CD4＋T cells in the priming and effector／memory phases ofa?doptive immunotherapy［J］.J Immunol，2000，165（8）：

Relationship between CD4＋and CD8＋T cells in peripheral blood and gastric cancer

ZHANGBao?guo．Department of Oncology，Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China

ObjectiveTo investigate the relationship of the presence of CD4＋，CD8＋T cells in peripheralblood with the pathologic characteristics and prognosis of gastric cancer.M ethodsFlowcytometry was used to analyze the number and proportion of CD4＋，CD8＋T cells in periphreral blood from 40 patientswith gastric cancer.The clinical data of the pa?tients were collected.The relationship of the proportion and number of CD4＋，CD8＋T cells with the pathologic data and prognosiswere statistically analyzed.ResultsThe number of CD4＋T cells had no correlation with age，differentiation and KPSscore.A higher number of CD4＋Twas detected in female patients（P＜0.05）.The number of CD8＋T cellswas sig?nificantly associated with gender and differentiation（P＜0.05），and notassociated with age and KPSscore（P＝0.15）.Both CD4＋and CD8＋Twere not associated with the prognosis of gastric cancer.The ratio of CD4＋／CD8＋was significantly associa?ted with KPS score，while not associated with age，gender and differentiation.Those patients with normal ratio of CD4＋／CD8＋had a higher KPS score（P＜0.05）and longer progression?free survival time（P＜0.05）.ConclusionsCD4＋and CD8＋T cellsmay have an important role in anti?tumor immune of gastric cancer.Detection of these two kinds of cells has clinical value on evaluating the prognosis of gastric cancer.

CD4＋T cell；CD8＋T cell；gastric cancer；prognosis

R 735.2

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2014.03.011

210006江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）腫瘤科