王 琰，王志強，柴三明，倪亞莉，安錦霞，馮 帆

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

早期補救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射在可疑受精障礙患者中的應(yīng)用

王 琰，王志強，柴三明，倪亞莉，安錦霞，馮 帆

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

目的 對體外受精—胚胎移植（IVF-ET）治療周期中可疑受精障礙患者采用早期補救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）和部分卵母細胞單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射（Half-ICSI）進行授精，比較兩種不同授精方式的臨床應(yīng)用效果。方法 回顧性分析2013年1—12月在我院進行IVF-ET治療的患者，對可疑受精障礙者采用早期補救性ICSI和Half-ICSI授精，比較兩種授精方式受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率及臨床妊娠率，探討兩種授精方式在可疑受精障礙患者中的臨床應(yīng)用價值。結(jié)果 早期補救性ICSI組受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯較Half-ICSI組高，差異有顯著性（P＜0.05）；而兩組在卵裂率、正常卵裂率、胚胎種植率以及臨床妊娠率之間差異無顯著性（P＞0.05）。早期補救性ICSI組臨床妊娠率較Half-ICSI組高4.11%。結(jié)論 IVF-ET常規(guī)授精失敗后行早期補救性ICSI可明顯提高受精率，是可疑受精障礙患者的最佳授精方式。

早期補救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射；可疑受精障礙；體外受精-胚胎移植；妊娠率

據(jù)報道，在體外受精—胚胎移植（IVF-ET）周期中，由于不孕患者本身以及臨床刺激方案等原因，低受精或不受精的發(fā)生率為10%～20%[1]。有研究表明，在IVF-ET常規(guī)授精18～20 h后實施補救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）可明顯提高受精率，但卻很難獲得高質(zhì)量的可利用胚胎而不能使臨床結(jié)局獲得有效改善[2]。隨著對卵子微觀結(jié)構(gòu)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)卵子在加精后2～4 h內(nèi)即可完成受精，受精后6 h，大部分受精卵會排出第二極體，從而方便觀察卵子的受精情況，有利于對卵子是否受精做出較明確的判斷而及早實施補救性ICSI[3，4]。雖然補救時ICSI可以有效解決卵母細胞不能正常受精的問題，但卻存在一些潛在的治療風(fēng)險[5，6]，因此，應(yīng)該嚴(yán)格把握ICSI的適應(yīng)證，為可疑受精障礙患者實施效果最佳、風(fēng)險最小的體外授精方式。目前，對可疑受精障礙患者常用的授精方式有早期補救性ICSI和部分卵母細胞單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射（Half-ICSI）兩種，本研究通過回顧性分析本中心接受兩種不同授精方式患者的相關(guān)資料，旨在尋找針對可疑受精障礙患者的最佳授精方式。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2013年1—12月在我院接受IVF-ET治療的，因可疑受精障礙而實施早期補救性ICSI或Half-ICSI并在同周期進行移植的患者101例，其中早期補救性ICSI組66例，Half-ICSI組35例。兩組患者均為原發(fā)性不孕，年齡＜35歲；女方至少一側(cè)輸卵管通暢；男方弱精癥但精液質(zhì)量未達ICSI指征。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性超排卵方案 所有患者均采用我院常規(guī)小針長方案促排卵[7]，即在前次月經(jīng)黃體中期開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，0.1 mg/支，Ipsen），達降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后給予重組卵泡刺激素（Gona-F，445 IU/支，Serono）或國產(chǎn)卵泡刺激素（麗申寶，75 IU/支，珠海麗珠藥業(yè)）150～300 IU/d直到HCG日。當(dāng)出現(xiàn)至少3個直徑大于18 mm的卵泡后于當(dāng)晚21時肌注HCG 5 000～10 000 IU，36 h后取卵。

1.2.2 精液處理 取卵當(dāng)日上午，男方采用手淫法將精液留取于一次性無菌精杯中，靜置于熱臺待液化后采用密度梯度離心法優(yōu)選精子，處理完畢后將優(yōu)選的精子沉淀輕輕加入已裝有平衡培養(yǎng)液的試管下層并置于CO2培養(yǎng)箱中使其再次上游，授精時取培養(yǎng)液上層精子。

1.2.3 授精方法及受精評估 早期補救性ICSI組：于注射HCG后38～40 h內(nèi)微滴授精，精子密度為2.8～3.0萬條精子/卵，加精后4 h觀察受精情況，若雙極體（2Pb）卵母細胞所占比例不足成熟卵子的50%，則繼續(xù)培養(yǎng)至6 h，仍不足50%則對0Pb和1Pb卵母細胞實施補救性ICSI。Half-ICSI組：將一半的卵母細胞以80 U/ml透明質(zhì)酸酶（Sage）拆除顆粒細胞后直接實施ICSI，剩余卵子常規(guī)IVF-ET授精。

16～18 h后評估卵母細胞受精情況，觀察到雙原核（2PN）為正常受精。

40 h、64 h后觀察胚胎分裂情況，根據(jù)卵裂球數(shù)目、大小是否均勻以及碎片數(shù)目評定胚胎等級，3d齡胚胎卵裂球數(shù)目≥7、碎片≤20%為優(yōu)質(zhì)胚胎；卵裂球數(shù)目≥5，碎片≤30%為可利用胚胎。根據(jù)患者自身情況每周期選擇2～3個胚胎進行移植。

1.2.4 臨床妊娠判定 胚胎移植后14 d血HCG陽性者為生化妊娠，5周后B超觀察到妊娠囊和胚胎原始心管搏動者為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料采用t檢驗進行比較，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05，差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

早期補救性ICSI組和Half-ICSI組在年齡、不孕年限、病因、Gn總量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、基礎(chǔ)FSH以及移植日子宮內(nèi)膜厚度間差異均無顯著性（P＞0.05），具有可比性（見表1）。

表1 早期補救性ICSI組和Half-ICSI組一般情況比較（±s）

表1 早期補救性ICSI組和Half-ICSI組一般情況比較（±s）

組別 年齡（歲）不孕年限（年）Gn總量（支）獲卵數(shù)（n）MⅡ卵數(shù)（n）基礎(chǔ)FSH（IU/L）內(nèi)膜厚度（mm）早期補救性ICSI組Half-ICSI組P 30.94±4.96 31.08±5.19＞0.05 5.98±2.60 6.42±4.01＞0.05 27.65±7.79 29.08±11.22＞0.05 10.82±4.88 9.66±5.22＞0.05 9.79±4.66 9.42±4.60＞0.05 6.56±1.51 6.81±1.29＞0.05 11.07±2.26 11.55±2.09＞0.05

2.2 兩種授精方式實驗室及臨床資料比較

與Half-ICSI組相比，早期補救性ICSI組受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯升高，差異有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）；而兩組在卵裂率、正常卵裂率、種植率之間無顯著性差異（P＞0.05）。早期補救性ICSI組臨床妊娠率較Half-ICSI組高，但差異無顯著性（P＞0.05），見表2。本次研究結(jié)果顯示，Half-ICSI組受精率和正常受精率明顯偏低，因此對所選對象進行分析，發(fā)現(xiàn)在Half-ICSI組中，有26例患者卵子采用IVF-ET常規(guī)授精后完全不能受精，9例患者常規(guī)IVF-ET后有僅部分卵子受精。

表2 早期補救性ICSI組和Half-ICSI組實驗室及臨床各指標(biāo)比較（%）

3 討論

受精障礙是影響IVF-ET的重要因素之一，引起受精障礙的因素很多，主要包括卵子成熟不良、精卵結(jié)合異常、卵母細胞不能正常激活等。據(jù)統(tǒng)計，目前國內(nèi)常規(guī)IVF-ET治療中，卵母細胞受精率為60%～70%，低受精或完全不受精占整個IVF-ET周期的10%～20%[1，8]。因此，如何提高可疑受精障礙患者卵母細胞受精率及利用率，是目前IVF-ET技術(shù)發(fā)展的焦點問題。

傳統(tǒng)的IVF-ET技術(shù)是在精卵結(jié)合后16～22 h脫去顆粒細胞，依受精情況決定是否進行補救性ICSI，但此種方法獲得的可利用胚胎和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)較少，胚胎質(zhì)量較差，很難得到理想的臨床妊娠率及分娩率[9]。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞若能正常受精，則有大約90%的受精卵在加精后6 h排出第二極體[10]，據(jù)此，人們提出采用早期補救性ICSI來防止低受精或不受精。Half-ICSI授精時，由于一半受精卵被直接實施ICSI授精，另一半采用常規(guī)IVF-ET受精，若卵母細胞受精能力正常，則部分受精卵由于被實施ICSI操作而加大了治療風(fēng)險，同時也增加了患者的治療費用；若卵母細胞受精能力低下或完全不能受精時，由于部分卵母細胞被實施常規(guī)受精而大大降低受精率，從而影響IVF-ET治療周期的卵母細胞利用率。早期補救性ICSI采用早加精IVF，6 h后對未受精卵母細胞進行補救性ICSI，從而避免出現(xiàn)過多卵母細胞不受精的情況，提高了IVF-ET治療周期的受精率，同時，能夠有效降低過度使用ICSI操作帶來的風(fēng)險。本次研究發(fā)現(xiàn)，Half-ICSI組中，卵母細胞受精率超過70%的周期數(shù)為9例，占總Half-ICSI周期數(shù)的25.7%，表明這些患者卵母細胞受精能力正常卻在IVF-ET治療中由于采用Half-ICSI進行受精而被過度實施ICSI操作，增加了治療風(fēng)險。同時，通過比較兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，早期補救性ICSI組受精率、正常受精率、可利用胚胎率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率均較Half-ICSI組高，表明早期補救性ICSI可明顯提高可疑受精障礙患者的卵母細胞利用率，從而增加患者的移植和妊娠機會，這與吳麗敏等[11]的研究結(jié)果相符。

另有文獻報道[12，13]，在體外受精精卵共培養(yǎng)時，高密度精子所產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物以及卵周顆粒細胞合成和釋放的各種細胞因子均可對卵母細胞產(chǎn)生細胞毒性作用，從而直接影響胚胎的后續(xù)發(fā)育、分裂以及種植，降低臨床妊娠率。采用Half-ICSI授精時，部分卵母細胞需要在未拆除顆粒細胞的狀態(tài)下與精子過夜共培養(yǎng)，使得這部分卵母細胞長時間遭受各種顆粒細胞釋放因子和精子代謝產(chǎn)物以及活性氧的侵蝕，從而降低了胚胎的后續(xù)發(fā)育能力，另一部分卵母細胞由于被直接實施ICSI操作而處于高風(fēng)險狀態(tài)。早期補救性ICSI后，需在較短的時間內(nèi)拆除顆粒細胞，觀察卵母細胞的受精情況并將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，如此則有效避免了卵母細胞或受精卵長時間承受精子和顆粒細胞的間接損傷，在很大程度上保護受精卵的后續(xù)發(fā)育能力。然而，與預(yù)期結(jié)果不同的是，本次研究數(shù)據(jù)顯示，早期補救性ICSI臨床妊娠率較Half-ICSI高4.11%，但卻無顯著性差異，這可能是由于每位患者在當(dāng)次周期內(nèi)僅移植2～3個胚胎，從而無法觀察兩種方法對患者最終妊娠結(jié)局的影響造成的。因此，要說明兩種不同授精方法對臨床妊娠率的影響，應(yīng)對二者累積妊娠率進行比較，但本次所選部分對象在首次移植未獲妊娠后未進行冷凍胚胎移植，因此，暫不討論兩種授精方法對IVF-ET最終結(jié)局的影響。

綜上所述，雖然早期補救性ICSI與Half-ICSI均能提高低受精和不受精卵母細胞的受精率，但綜合各因素評價，早期補救性ICSI在提高受精率、增加卵母細胞利用率以及改善患者治療結(jié)局方面更優(yōu)于Half-ICSI，是可疑受精障礙患者進行IVF-ET治療的首選授精方式。

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