郭 強(qiáng)

（河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003）

延壽片收載于 《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二冊，由何首烏、豨薟草、菟絲子、杜仲、女貞子、桑葉等14味中藥組成，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)壯筋骨之功效。用于肝腎不足，頭昏目花，耳鳴重聽，四肢酸麻，腰酸無力，夜尿頻數(shù)，須發(fā)早白等癥[1]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只收載了性狀和檢查項，并無定性鑒別和含量測定，為了有效地控制該制劑的質(zhì)量，本文采用TLC法對何首烏、豨薟草進(jìn)行了鑒別，采用HPLC法測定何首烏中二苯乙烯苷的含量，作為控制本制劑內(nèi)在質(zhì)量的指標(biāo)。

1 材料

Waters2695高效液相色譜儀 （配四元泵、自動進(jìn)樣器、Waters2487紫外檢測器）；安捷倫1100高效液相色譜儀 （配四元泵、自動進(jìn)樣器、VWD紫外檢測器）；延壽片 （內(nèi)部自制）；何首烏對照藥材 （批號：120934-200507，供鑒別用）；奇壬醇 （批號：111726-200604，供含量測定用）；二苯乙烯苷 （批號：110844-200607，供含量測定用），乙腈為德國Merck公司色譜醇，水為超純水，其余溶劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1 .1 何首烏的鑒別[2]取本品0.3g，研細(xì)，加入三氯甲烷50ml，超聲10分鐘，放冷，濾過，殘渣加乙醇50ml，加熱回流1小時，濾過，濾液濃縮至3ml，作為供試品溶液。另取何首烏對照藥材0.25g，同法制成對照藥材溶液。按其處方比例制備不含何首烏的陰性樣品，照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法 (附錄ⅥB)試驗：吸取上述三種溶液各2μl，分別點于同一用羧甲基纖維素鈉制備的硅膠H薄層板上使成條狀，以三氯甲烷-甲醇 （7∶3）為展開劑，展至約3.5cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇 （20∶1∶1為展開劑， 展至約7cm，取出， 晾干， 置紫外燈 （365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.1 .2 豨薟草的鑒別[2-4]取本品3g，研細(xì)，加入三氯甲烷50ml，超聲20分鐘，放冷，濾過，殘渣加入甲醇10ml，超聲處理15分鐘，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取奇壬醇對照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法 (附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點于同一用羧甲基纖維素鈉制備的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇 （4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

2.2 二苯乙烯苷的含量測定[2，5-6]

2.2 .1 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，過四號篩，取約0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，搖勻，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 .2 對照品溶液的制備 精密稱取二苯乙烯苷對照品適量，加稀乙醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。

2.2 .3 陰性對照品溶液的制備 按處方取不含二苯乙烯苷的其他藥材，照本制劑的制備工藝制成陰性對照制劑，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2 .4 色譜條件 用十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水 （25∶75）為流動相，檢測波長為320nm，流速1.0ml·min-1， 柱溫35℃， 進(jìn)樣量10μl， 理論板數(shù)按二苯乙烯苷峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2 .5 陰性干擾試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μl，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，供試品色譜中在與對照品色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，而陰性對照色譜中在與對照品色譜相應(yīng)位置上則未出現(xiàn)明顯色譜峰，表明在該HPLC測定條件下，二苯乙烯苷的測定無明顯干擾。見圖1。

圖1延壽片樣品HPLC色譜圖

2.2 .6 線性關(guān)系考察 精密取二苯乙烯苷對照品，分別制 成 濃 度 為 102.4μg/ml、 204.8μg/ml、 307.2μg/ml、409.6μg/ml、 512.0μg/ml的樣品， 進(jìn)樣量10μl， 測定峰面積，將進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行線性回歸處理，方程為Y=2087652X-55963 （r=0.9999），二苯乙烯苷在102.4～512.0μg/ml之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2 .7 精密度 精密吸取同一對照品溶液10μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積積分值，結(jié)果RSD=0.53%，表明精密度良好。

2.2 .8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液 （批號：100204）10μl，分別在0， 2，4，6， 8， 10h注入液相色譜儀中，測定二苯乙烯苷峰面積，結(jié)果表明本品在10h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=0.5%。

2.2 .9 重復(fù)性試驗 取同一批號 （批號：100204）樣品6份，按供試品溶液制備方法制備6份供試液，分別測定二苯乙烯苷含量，結(jié)果含量平均值為6.25mg·g-1，RSD=1.2%，表明樣品的重復(fù)性良好。

2.2 .10 加樣回收率試驗 取本品已知含量的樣品 （批號：100204，二苯乙烯苷含量：6.25mg·g-1）6份，每份約0.3g， 精密加入對照品溶液 （濃度：0.076mg·ml-1，配制方法：精密量取二苯乙烯苷對照品15.20mg，加入稀乙醇溶解并定容至200ml）25ml，按上述含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表1，平均回收率為100.0%，RSD=2.17%。

表1二苯乙烯苷回收率測定 (n=6)

2.2 .11 樣品測定 取10批樣品按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，注入液相色譜儀，按2.2.4的色譜條件進(jìn)樣并按外標(biāo)一點法測定，測定十批樣品的含量測定結(jié)果見表2。

表2樣品含量測定

根據(jù)表2結(jié)果，10批樣品含量測定結(jié)果的平均值為6.25mg·g-1，按含量結(jié)果平均值的80%折算成每片的含量作為含量測定的指標(biāo)，暫定本品每片含何首烏以二苯乙烯苷（C20H22O9）計，不得少于5mg。

3 討論

3.1 指標(biāo)選定依據(jù) 何首烏為方中君藥，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的療效，用于瘡癰，瘰疬，風(fēng)疹瘙癢，久瘧體虛，腸燥便秘。制法中一部分何首烏與黑豆煎煮濃縮成稠膏，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂的功效，主要用于血虛萎黃，眩暈耳鳴，須發(fā)早白，腰膝酸軟，肢體麻木，崩漏帶下，高脂血癥。二苯乙烯苷是何首烏的主要藥理活性成分，因此將鑒別何首烏對照藥材和何首烏中二苯乙烯苷的定量列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。豨薟草為方中臣藥，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、解毒的功效，用于風(fēng)濕痹痛，筋骨無力，腰膝酸軟，四肢麻痹，半身不遂，風(fēng)疹濕瘡。選定豨薟草列入本品鑒別項。

3.2 薄層鑒別方法選定過程 薄層色譜研究中，曾選定對桑葉、地黃、牛膝進(jìn)行鑒別研究，結(jié)果供試品色譜相應(yīng)的位置上，斑點微弱不易見，同時陰性對照有干擾?？紤]是處方投料較少，同時處方藥味較多?？紤]暫不列入標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 含量測定方法的選擇 參照相關(guān)文獻(xiàn)，二苯乙烯苷含量測定方法比較成熟，而且HPLC方法準(zhǔn)確度高，專屬性好。

3.4 含量測定提取方法選擇 含量測定中，對供試液提取溶劑選用了甲醇、70%甲醇、乙醇、稀乙醇四種，結(jié)果只有稀乙醇提取的二苯乙烯苷含量相對較高，且藥典何首烏項下也是用稀乙醇提取，故選定稀乙醇作為提取溶劑。提取方法比較了超聲提取和回流提取，結(jié)果同為30分鐘時間條件下，回流所得含量更高；加入稀乙醇量比較了10ml、25ml、50ml，結(jié)果同樣條件下，10ml所得含量結(jié)果較小，而25ml與50ml的結(jié)果接近，故選用加入稀乙醇25ml，回流30分鐘作為本品的提取方法。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑，第二冊[S].北京，1990：98.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典，一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：164-165，345-346.

[3]林達(dá)，洪美華.薄層色譜法鑒別心舒寧片中的豨薟草[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志，2007，17（4）：41-42.

[4]王術(shù)平，張淑香，張彥文，等.舒樂沖劑中豨薟草的定性鑒別[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（5）：188.

[5]李濤，王天志.HPLC測定制首烏及首烏延壽片中二苯乙烯苷的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20（5）：436-438.

[6]陳小凱，段啟，何偉，等.麒麟丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究[J].中國藥房，2013，24（23）：2164-2166.