裴 亮 雷 鳴 姚長義 王義寶

（1.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，110041；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科）

·基礎(chǔ)研究·

BMECs經(jīng)TCM和ACM條件培養(yǎng)Caveolin-1的表達(dá)對比及其機(jī)制的探討

裴 亮1雷 鳴1姚長義2王義寶2

（1.遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，110041；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科）

目的 探討Caveolin-1在大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞件培養(yǎng)液（TCM）和星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液（ACM）條件培養(yǎng)對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）表達(dá)的關(guān)系。方法 對BMECs進(jìn)行原代培養(yǎng)，以TCM進(jìn)行培養(yǎng)，以ACM進(jìn)行培養(yǎng)作為對照，進(jìn)行免疫熒光染色和Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)情況。結(jié)果 免疫熒光顯示BMECs中Caveolin-1的表達(dá)定位于細(xì)胞漿，實(shí)驗(yàn)組染色強(qiáng)度高于對照組；Western blot蛋白測定結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的IDV灰度值為60 831±2 865.197，明顯高于對照組的IDV灰度值18 645±3 607.659，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Caveolin-1在TCM培養(yǎng)BMECs細(xì)胞中高表達(dá)，驗(yàn)證了組織微環(huán)境改變可以引起周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞表型改變這一假設(shè)，為膠質(zhì)瘤靶向治療載體的選擇上提供了一定的理論依據(jù)。

Caveolin-1；大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞件培養(yǎng)液；星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液；腦血管內(nèi)皮細(xì)胞；膠質(zhì)瘤

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，由于血腫瘤屏障的存在，化療藥物被限制進(jìn)入腫瘤組織[1]122-129，而選擇性開放血腦腫瘤屏障能夠有效增加化療藥物在腦膠質(zhì)瘤組織中的濃度，對腦膠質(zhì)瘤的治療具有十分重要的意義。Caveolin-1是 Caveolae的標(biāo)志性蛋白，分子質(zhì)量為21～24 kDa，修飾于Caveolae的內(nèi)表面，是質(zhì)膜微囊的結(jié)構(gòu)蛋白和最好的生物標(biāo)記物。本研究通過制備大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液（TCM）和星形細(xì)胞培養(yǎng)液條件培養(yǎng)（ACM）的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs），再通過免疫熒光和Western blot檢測BMECs的Caveolin-1的表達(dá)，從而探究TCM和ACM不同條件培養(yǎng)對BMECs種Caveolin-1表達(dá)的影響，以進(jìn)一步影響血腦屏障的通透性，為進(jìn)一步開發(fā)新型高選擇性靶向性的膠質(zhì)瘤化療藥物載體提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 II型膠原酶(Sigma)、葡聚糖(Serva)、DMEM培養(yǎng)液(Gibco)、胰蛋白酶(Gibco)、胎牛血清(TBD)、TritonX-100(Sigma)、Caveolin-1單克隆抗體(Santa Cruz)、兔抗Caveolin-1多克隆抗體(Santa Cruz)、抗小鼠免疫球蛋白和辣根過氧化酶（北京中山生物技術(shù)公司）、FITC-抗兔（北京中山生物技術(shù)公司）、Wistar胎大鼠（1周內(nèi)，中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.2 方法 對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組以TCM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，對照組以TCM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。分別對實(shí)驗(yàn)組和對照組中的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行Caveolin-1的免疫熒光染色。熒光顯微鏡觀察，采集圖像。Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)和分布。結(jié)果用Chemi Imager 5500 V2.03軟件掃描，F(xiàn)luro Chen2.0軟件定量分析顯色條帶的IDV數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光顯示法檢測BMECs中Caveolin-1的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組高于對照組。見圖1。

2.2 Western blot檢測Caveolin-1表達(dá)和分布 在Western blot蛋白測定的條帶上見實(shí)驗(yàn)組以TCM進(jìn)行培養(yǎng)的BMECs中Caveolin-1的表達(dá)要明顯高于對照組。IDV灰度值測定后統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、表1和圖3（封三）。

3 討論

3.1 Caveolae與Caveolin-1 有研究發(fā)現(xiàn)增量調(diào)節(jié)Caveolin-1蛋白能夠提高CRM197介導(dǎo)的血腦屏障的通透性[2]，如果轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤組織的化療藥物濃度增加2倍，其殺傷腫瘤的能力將提高10倍[3]。近年來的研究證實(shí)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜均存在燒瓶狀的內(nèi)陷微區(qū)結(jié)構(gòu)，即質(zhì)膜微囊（Caveolae），它們富含鞘脂和膽固醇，此區(qū)域與細(xì)胞間黏著結(jié)合和緊密連接密切相關(guān)[4]，質(zhì)膜微囊被認(rèn)為與細(xì)胞的吞飲作用及物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等功能密切相關(guān)，它參與許多細(xì)胞生命活動(dòng)。Caveolin-1是Caveolae的標(biāo)志性蛋白，分子質(zhì)量為21～24 kDa，修飾于Caveolae的內(nèi)表面，是質(zhì)膜微囊的結(jié)構(gòu)蛋白和最好的生物標(biāo)記物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光觀察和Western blot蛋白測定發(fā)現(xiàn)BMECs中的Caveolin-1在TCM液培養(yǎng)后表達(dá)明顯高于ACM培養(yǎng)后的表達(dá)，如利用Caveolin-1在腦瘤屏障中高表達(dá)是否能制造出特異性高，能選擇性開放血腫瘤屏障的靶點(diǎn)為開發(fā)臨床新型高選擇性開放血腫瘤屏障藥物提供理論支持。但是需要注意的是某些因素如N-乙酰半胱氨酸的缺乏和綠茶多酚能夠降低Caveolin-1的表達(dá)和血腦屏障作用的減弱[5]。本研究發(fā)現(xiàn)在TCM培養(yǎng)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞Caveolin-1表達(dá)上調(diào)，而有利于促進(jìn)血腫瘤屏障的開放。一方面可以通過此途徑進(jìn)行化療，提高化療藥物的使用效率，另一方面由于血腫瘤屏障的開放，腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，浸潤到正常組織中更加容易，亦能夠解釋研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤有關(guān)的原因。故上調(diào)或降低Caveolin-1的表達(dá)是個(gè)雙刃劍，需要更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

表1 ACM和TCM 培養(yǎng)BMEC中Caveolin-1的Western blot的數(shù)據(jù)

3.2 TCM、ACM與BMECs 膠質(zhì)瘤組織中的血腫瘤屏障與正常腦組織的血腦屏障在結(jié)構(gòu)和功能上存在著很大差異，目前膠質(zhì)瘤腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的血腦屏障特性差異的分子機(jī)制還不清楚。但膠質(zhì)瘤腦血管超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮之間緊密連接出現(xiàn)異常[6]。緊密連接由一組分子所構(gòu)成，包括oc-cludin和連接粘附分子等。國外學(xué)者通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)肺癌周圍的微血管內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá)某些特異性蛋白，而這些蛋白大多參與內(nèi)陷微區(qū)的構(gòu)成[1]122-129，此研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了組織微環(huán)境改變可以引起周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞表型改變這一假設(shè)。前期抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤微血管段存在著特異性的mRNA表達(dá)，提示膠質(zhì)瘤微環(huán)境很可能引起附近腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的表型變化，進(jìn)而影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血腦屏障的特性。本研究通過TCM培養(yǎng)和ACM培養(yǎng)的BMECs，通過免疫熒光標(biāo)記和Western blot蛋白測定Caveolin-1的表達(dá)，進(jìn)一步證明了BMECs膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。

3.3 TCM對BEMCs轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響 腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞賴以生存，并對其生命活動(dòng)產(chǎn)生影響和作用的所有外界環(huán)境的總稱。如果腫瘤在沒有足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的微環(huán)境中，腫瘤只能長到幾立方毫米，為了向外擴(kuò)展腫瘤必須通過血管生成獲取氧氣和營養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生早期即促進(jìn)血管生成。因此膠質(zhì)瘤表現(xiàn)為高度血管化，并且微血管與正常血腦屏障不同，膠質(zhì)瘤腦血管超微結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮之間緊密連接出現(xiàn)異常。Zhong Y發(fā)現(xiàn)Caveolin-1能夠調(diào)節(jié)HIV-1介導(dǎo)緊密連接蛋白表達(dá)的改變[7]。大量研究結(jié)果從不同方面充分證明了形成血腦屏障并非腦血管內(nèi)皮細(xì)胞固有的內(nèi)在特性，而是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用所致[8-9]。鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞存在誘導(dǎo)并維持腦血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血腦屏障的作用，膠質(zhì)瘤微環(huán)境對腦血管內(nèi)皮血腦屏障的影響可能更為復(fù)雜[10]，我們的體外試驗(yàn)顯示TCM條件培養(yǎng)可以明顯增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上Caveolin-1的表達(dá)以及質(zhì)膜微囊的數(shù)量，并且TCM條件培養(yǎng)可以提高小劑量緩激肽作用后BMECs對大分子物質(zhì)的通透性。結(jié)合Fisher等[11]的研究結(jié)果我們推測，雖然TCM不能直接增加BMECs上緊密連接的通透性，但是極可能影響B(tài)MECs上轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)區(qū)域，特別是質(zhì)膜微囊的表達(dá)，從而在某種程度上提高了血腫瘤屏障的可調(diào)控幅度，這為選擇性開放血腫瘤屏障提供了可能的靶點(diǎn)。雖然質(zhì)膜微囊不直接參與細(xì)胞間緊密連接的形成，但是實(shí)驗(yàn)表明上皮細(xì)胞系緊密連接相關(guān)蛋白的解體、吞飲、再分布以及重新聚合同質(zhì)膜微囊有著密切的關(guān)系。

4 結(jié)論

TCM和ACM培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察和Western blot檢測，Caveolin-1在TCM培養(yǎng)BMECs細(xì)胞中高表達(dá)。說明在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中BMECs中Caveolin-1高表達(dá)，從而驗(yàn)證了組織微環(huán)境改變可以引起周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞表型改變這一假設(shè)，對為進(jìn)一步開發(fā)新型高選擇性靶向性的膠質(zhì)瘤化療藥物載體提供理論依據(jù)。

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R65

A

1672-7185（2014）04-0056-03

10.3969/j.issn.1672-7185.2014.04.033

姚長義

2013-11-29）