馮曉紅，王 蕾，王秀云，張果忠

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津300193 ; 2.天津武警醫(yī)學院，天津300162)

腦血管病中腦梗死占大多數(shù)，其中大腦中動脈分布區(qū)的發(fā)病率最高。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn):井穴放血法可提高腦梗塞大鼠存活率及減小梗死面積［1-2］。為進一步探索針藥結(jié)合對實驗性腦缺血大鼠細胞凋亡的影響，筆者采用免疫組化法對腦缺血大鼠缺血區(qū)Bcl-2、Bax 的表達進行了觀察，總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF 級健康成年雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量220 ～250 g，由軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物實驗中心提供，許可證編號:SCXK -(軍)2009 -003。

1.2 藥 品

安宮牛黃丸，由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠提供，批號1017031;尼莫地平，由天津市中央藥業(yè)有限公司提供，批號110704。

1.3 永久性大腦中動脈栓塞模型的建立

參照Longa 法，并稍作改良:以質(zhì)量分數(shù)100 g/L 的水合氯醛按350 ～400 μg/g 體質(zhì)量腹腔麻醉;分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈;頸總動脈近心端5-0 絲線結(jié)扎，頸內(nèi)動脈處預置5 -0絲線扎活扣備用，在活扣的遠心端用動脈夾夾閉頸總動脈;在頸總動脈距分叉部1 ～2 mm 處用眼科剪剪1 個小口，緩慢插入線栓(直徑約為0.37 mm 魚線，頭端為鈍頭，用指甲油處理)，迅速去掉動脈夾并將活扣扎緊;緩慢插線栓，直到遇到阻力為止，插入深度距分叉處(18 ± 0. 5)mm，將活扣處結(jié)扎1 次;記錄栓塞時間;再次結(jié)扎頸總動脈近心端，并固定線栓暴露部分，留鼠體內(nèi)約3 mm，其余剪除;清理傷口，縫合后使用結(jié)晶磺胺于傷口處消毒、抗感染。

1.4 針刺選穴

選取手十二井穴。穴位定位:采用比較解剖學，參考人體相應穴位解剖標志，在大鼠前肢各趾的相應部位選取，即取位于大鼠雙側(cè)前肢趾端的少商、商陽、中沖、關(guān)沖、少沖、少澤，每側(cè)6 個穴位，共12 個。

1.5 分組與處理

將大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組和治療組(分手十二井穴放血組、安宮牛黃丸組、針藥結(jié)合組、尼莫地平組，各組又分為缺血6 h、24 h、48 h、72 h 4 個時間段)。除正常對照組、假手術(shù)組每組5 只動物外，其余每組10 只。

正常對照組:同樣抓取，不進行任何處理。假手術(shù)組:分離一側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，縫合消毒。模型對照組:大鼠大腦中動脈栓塞造模，不予治療。十二井穴放血組:用處理后的采血針于大鼠雙側(cè)前肢端的十二井穴點刺放血，出血量以血盡為止。安宮牛黃丸組:按0.25 g/kg 體質(zhì)量灌胃給藥。針藥結(jié)合組:井穴放血+安宮牛黃丸灌胃。尼莫地平組:按0.1g/kg 體質(zhì)量灌胃給藥。井穴放血，每天放血2 次;藥物灌胃，每天1 次。

1.6 檢測指標

每組大鼠于各時間點分別灌注、取腦、制作石蠟切片，用免疫組化法檢測Bax、Bcl-2 的表達。免疫組織化學染色法嚴格按照操作程序進行。采用Mias 圖像處理系統(tǒng)，每只大鼠各取1 張免疫組化切片，在梗死灶周邊區(qū)隨機取5 個視野，對Bax、Bcl-2表達進行觀察及分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

各組大鼠腦組織Bax、Bcl-2 陽性細胞數(shù)及Bcl-2/Bax 對比結(jié)果見表1 ～3。①與模型對照組對比，缺血6 h，各組Bax、Bcl-2 陽性細胞數(shù)除尼莫地平組外，差別均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。從比值來看，針藥結(jié)合組效果顯著，井穴放血組和安宮牛黃丸組次之，但組間對比差別無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。說明針藥結(jié)合組在中風初期抑制細胞凋亡效果顯著。②缺血24 h 時，與模型對照組對比，除尼莫地平組外，其他各組Bax 陽性細胞數(shù)明顯減少，差別均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);各組Bcl-2 陽性細胞與模型對照組對比，差別均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。從比值來看，針藥結(jié)合效果最佳，井穴放血組次之。③缺血48 h 時，與模型對照組對比，其余各組Bcl-2陽性細胞數(shù)增多，差別均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);Bax 陽性細胞數(shù)減少，只有假手術(shù)組和尼莫地平組差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。從比值來看，針藥結(jié)合組效果最佳，但與48 h 之前相比，比值下降，其余各治療組對比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0．05)。說明超出時間窗，針藥結(jié)合治療效果下降，抑制細胞凋亡能力減弱。④缺血72 h 時，與模型對照組對比，除安宮牛黃丸組外，其余各組Bax 陽性細胞數(shù)減少，差別均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01);假手術(shù)組Bcl-2 陽性細胞數(shù)減少，各治療組增多，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。結(jié)果表明:從比值來看，中醫(yī)藥各治療組與尼莫地平組對比，差別均無統(tǒng)計學意義(P ＞0．05)。說明在腦缺血48 h 之后，各種治療手段效果都不顯著，但仍優(yōu)于模型對照組。

表1 各組大鼠腦組織Bax 陽性細胞數(shù)對比

表1 各組大鼠腦組織Bax 陽性細胞數(shù)對比

注:與同時段的模型對照組對比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與同時段的針藥結(jié)合組對比，# P ＜0.05，## P ＜0.01;與同時段的尼莫地平組對比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組 別 動物數(shù)6 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 5 0.60±0.84＊＊假手術(shù)組 5 0.80±1.03＊＊ 0.62±1.29＊＊ 0.39±0.25＊＊ 0.9±1.04＊＊模型對照組 10 42.30±2.87 40.60±3.34 40.00±3.27 41.80±4.42安宮牛黃丸組 10 34.80±4.32＊＊## 32.30±3.13＊＊#△△ 38.40±3.89 38.1±4.15* #井穴放血組 10 34.00±2.87＊＊##△ 34.00±1.76＊＊#△ 38.90±3.25 39.00±2.62#針藥結(jié)合組 10 31.00±2.79＊＊△△ 31.20±5.16＊＊△△ 37.10±3.45 41.00±4.52尼莫地平組 10 40.80±3.26 40.60±4.17 39.0±4.22＊＊ 38. ±3.33＊＊

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2 陽性細胞數(shù)對比

表2 各組大鼠腦組織Bcl-2 陽性細胞數(shù)對比

注:與同時段的模型對照組對比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與同時段的針藥結(jié)合組對比，# P ＜0.05，## P ＜0.01;與同時段的尼莫地平組對比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組 別 動物數(shù)6 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 5 1.70±0.95＊＊假手術(shù)組 5 1.60±1.17＊＊ 1.25±0.1＊＊ 0.69±1.91＊＊ 1.04±0.21＊＊模型對照組 10 19.30±4.35 13.70±3.40 16.40±3.86 17.00±2.58安宮牛黃丸組 10 23.80±3.71＊＊# 22.00±3.74＊＊## 25.0±2.83＊＊# 25.3±2.26＊＊井穴放血組 10 23.90±4.41＊＊# 23.90±3.38＊＊## 26.1±4.95＊＊#△ 24.9±4.18＊＊針藥結(jié)合組 10 25.70±3.06＊＊△△ 26.00±4.08＊＊△△ 27.4±3.89＊＊ ＊＊△ 26.4±4.62＊＊尼莫地平組 10 21.20±3.29 21.80±3.08＊＊ 23.4±4.70＊＊ 25.1±2.51＊＊

表3 各組大鼠腦組織Bcl-2/Bax 對比

3 討 論

目前認為:Bcl-2 表達是抑制凋亡的一個關(guān)鍵因素，可通過直接抑制線粒體對細胞色素C 的通透性增高，抑制Bid 和Bax 介導的細胞色素C 釋放，間接抑制caspase 前體的激活，從而阻斷細胞凋亡的發(fā)生。Bax 是和Bcl-2 類似的蛋白，但兩者作用完全相反。當細胞受到死亡信號刺激后，Bax 發(fā)生構(gòu)象變化，與抗凋亡蛋白發(fā)生相互作用，使線粒體膜通透性發(fā)生改變，釋放細胞色素C，并與凋亡蛋白酶激活因子1 結(jié)合，順序激活Caspase-9、Castpase-3，最終導致細胞凋亡［3］。高表達的Bcl-2 可使去除神經(jīng)生長因子的交感神經(jīng)元繼續(xù)存活，而Bax 的過度表達則能對抗Bcl-2 對細胞凋亡的抑制作用。當Bcl-2 與Bax結(jié)合，形成Bcl-2/Bax 異二聚體時，可阻止Bax 插入線粒體外膜［4-5］，保護線粒體電勢梯度，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的自穩(wěn)狀態(tài)和氧化還原狀態(tài)等，從多個方面抑制凋亡發(fā)生;但當Bcl-2 與Bax 的結(jié)合點斷裂，則Bcl-2對細胞的保護性消失，說明Bcl-2 必須結(jié)合Bax 才能發(fā)揮其作用［6］。

腦缺血-再灌注后對腦的保護治療能夠恢復正常神經(jīng)功能的缺血半暗帶內(nèi)神經(jīng)組織的存活時間段常被稱為腦的保護治療“時間窗”［7］。本實驗研究發(fā)現(xiàn):大鼠海馬區(qū)Bcl-2 表達于缺血后6 h 時明顯增加，48 h 時達高峰，以后趨于平穩(wěn)。Bcl-2 表達增加的時程和腦缺血耐受產(chǎn)生的時間窗基本吻合［8］，提示Bcl-2 表達增加可能是缺血后干預產(chǎn)生腦保護作用的重要機制。腦缺血早期Bcl-2 表達相對增強，隨著腦缺血時間的延長，促凋亡蛋白Bax 的表達逐漸相對增強，神經(jīng)細胞開始出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變。Bcl-2 與Bax 的比值對決定細胞凋亡起關(guān)鍵作用，比值增大時促進細胞存活，反之則導致細胞死亡［9］。本實驗中，安宮牛黃丸組和井穴放血組在腦缺血后6，24，48，72 h 4 個時段Bax、Bcl-2 比值無明顯變化，但均高于模型對照組，且在6，24 h 時高于尼莫地平對照組;針藥結(jié)合組在腦缺血后6，24 h Bcl-2、Bax比值最大，此表明:在腦缺血早期，安宮牛黃丸和井穴放血相結(jié)合治療急性缺血性中風效果最佳，能有效地抑制細胞凋亡，但在缺血后48，72 h，尼莫地平對照組Bcl-2、Bax 比值超過了井穴放血組、安宮牛黃丸組和針藥結(jié)合組，效果相對較好?？梢姵^時間窗后，傳統(tǒng)中醫(yī)療法抑制細胞凋亡能力下降，正如古籍中描述安宮牛黃丸“無論陰閉、陽閉，唯需早用”，且安宮牛黃丸含有重金屬，對大鼠的耐受水平也是一種考驗，故安宮牛黃丸不宜久服。

此外，實驗還發(fā)現(xiàn):在缺血干預后變化幅度方面，Bax 表達較小，Bcl-2 卻明顯較大，兩者比值增高。此現(xiàn)象意味著缺血后干預可能通過上調(diào)Bcl-2表達，減輕神經(jīng)細胞凋亡，產(chǎn)生腦保護作用，而Bax在此過程中不起重要作用。此結(jié)果有待今后進一步驗證。

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