樓鈳楠，周建慶，毛海燕，葛世俊，沈文均，陳?ài)凭?，麻付?/p>

PD-118057藥物拯救負(fù)顯性機(jī)制E637K-hERG通道的研究

樓鈳楠，周建慶，毛海燕，葛世俊，沈文均，陳?ài)凭?，麻付?/p>

目的探討PD-118057對(duì)于糾正負(fù)顯性機(jī)制E637K-hERG蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的作用。方法全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)PD-118057干擾各種細(xì)胞模型前后hERG編碼的快速激活延遲整流性鉀電流（IKr）變化；采用Western blot分析PD-118057負(fù)顯性機(jī)制E637K-hERG蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙。結(jié)果PD-118057干擾WT-hERG后，激活電流和尾電流的電流幅度都較干擾前明顯增大，但不改變通道電流的特性，只加速了通道電流的穩(wěn)態(tài)失活速度。而PD-118057干擾WT/E637K-hERG前后電流幅度和通道特性都沒(méi)有明顯變化。Western blot結(jié)果與膜片鉗結(jié)果相符合。結(jié)論P(yáng)D-118057不能糾正負(fù)顯性機(jī)制E637K-hERG通道功能。

快激活延遲整流性鉀離子電流；藥物評(píng)價(jià)；PD-118057

近年來(lái)，新發(fā)現(xiàn)的hERG/KCNH2通道激活劑能夠增大快激活延遲整流性鉀電流（IKr）而不引起hERG通道阻滯。根據(jù)通道激活劑激活的電生理特性分為兩類(lèi)，RPR260243為經(jīng)典的I型hERG通道激活劑，而PD-118057是2型hERG通道激活劑[1]。Zhou等[2]研究發(fā)現(xiàn)，PD-118057能夠顯著性增大IKr電流而不影響hERG通道特性。另外有研究報(bào)道，另一種2型hERG通道激動(dòng)劑NS1643能夠糾正位于S6區(qū)域的Phe656突變，而尚未有報(bào)道關(guān)于PD-118057對(duì)hERG突變體影響的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在探討PD-118057對(duì)WT-hERG和WT/E637K-hERG電流幅度和離子通道特性的影響，以及PD-118057對(duì)糾正負(fù)顯性機(jī)制E637K-hERG蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分野生型（WT-hERG）、雜合型（WT/E637K-hERG）及突變型（E637K-hERG）三個(gè)細(xì)胞模型。每個(gè)細(xì)胞模型又分實(shí)驗(yàn)組（PD-118057孵育）和對(duì)照組（未加入PD-118057）。

1.2 材料質(zhì)粒pGEM-HERG、pcDNA3購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；載體pGEM-T購(gòu)自美國(guó)Promega公司；DMEM（Dulbecco'sModified Eagle M edium）購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司；轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectam inTM 2000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PD-118057購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗hERG多克隆抗體購(gòu)自以色列A lomone公司；蛋白裂解液PMSF購(gòu)于北京Solarbio公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體及BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒均購(gòu)于北京ZSGB-BIO公司；引物合成及測(cè)序由TaKaRa公司完成；PCR擴(kuò)增儀PE 7700購(gòu)自美國(guó)PE公司；膜片鉗系統(tǒng)及分析軟件為美國(guó)Axon公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 pGEM-HERG-E637K突變體構(gòu)建HERG cDNA通過(guò)Bam HI和EcoRI酶切位點(diǎn)插入到pcDNA3載體中。擴(kuò)增引物利用PrimerPrem ier5.0軟件設(shè)計(jì)兩條HERG基因外側(cè)端引物；另外以pGEMHERG為模板，根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）構(gòu)建HERGE637K突變片段，將構(gòu)建的目的片段重組至pGEM-T載體進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及藥物干擾

HEK293細(xì)胞常規(guī)用含10%FBSDMEM培養(yǎng)基，放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將3.2 gWT-hERG質(zhì)粒和/或3.2 g E637K-hERG質(zhì)粒，根據(jù)Lipofectam inTM 2000說(shuō)明書(shū)提供的實(shí)驗(yàn)步驟，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建WT-hERG，WT/E637K-hERG及E637K-hERG細(xì)胞模型。同時(shí)共轉(zhuǎn)染0.8 g綠色熒光蛋白pRK5-GFP以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。24h后在HEK 293細(xì)胞培養(yǎng)及中加入PD-118057，終濃度為3 mol/L，繼續(xù)孵育24或48h。

1.3.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄法室溫下（24～26℃）采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察PD-118057對(duì)WT-hERG，WT/ E637K-hERG，E637K-hERG IKr電流的影響。細(xì)胞外液：NaCl137mmol/L，KCl 4 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，M gCl2· 6H2O 1mmol/L，glucose10mmol/L，HEPES 10 mmol/L（用NaOH將pH調(diào)至7.4）。電極內(nèi)液：KCl130mmol/L，MgCl21 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，M g-ATP 6 mmol/L，HEPES 10mmol/L（用KOH將pH調(diào)至7.2）。設(shè)置激活電流方案：細(xì)胞鉗制在－80mV，測(cè)試電壓從－60mV，以10mV的階躍，刺激到+60m V，持續(xù)2s；然后去極化到－40mV，持續(xù)4s；最后回到－80m V。擬合用Boltzmann方程：I=Imax×[1+exp（V1/2－Vm）/k]－1（其中Imax為最大激活電流，V1/2為半激活最大電壓，k表示斜率因子）。失活電流刺激程序：測(cè)試電壓從－130m V開(kāi)始刺激，以10mV階躍幅度增長(zhǎng)，到達(dá)20mV時(shí)鉗制并記錄電流，時(shí)程20ms。失活時(shí)間常數(shù)刺激程序：將測(cè)試電壓鉗制在60 m V，持續(xù)2s；然后復(fù)極到－100m V，時(shí)程10ms，緊接著從－60mV以10mV的階躍幅度刺激到+60mV，持續(xù)3 s，記錄電流。失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)刺激程序設(shè)置：鉗制電壓－80m V，復(fù)極到50mV使通道失活，然后將電壓從－30mV以10 m V階躍幅度刺激到－120 mV，持續(xù)3 s，記錄電流。去失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)刺激程序同失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)[3]。

1.3.4 Westernblot Westernblot分析藥物干預(yù)不同細(xì)胞模型前后蛋白表達(dá)情況。收集各個(gè)細(xì)胞模型對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，加入預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液。取細(xì)胞裂解上清液20 l，點(diǎn)樣于8%SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)封閉液室溫封閉2h。一抗采用兔抗hERG多克隆抗體，以1∶400稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。二抗采用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，稀釋比為1∶800，室溫孵育2 h。BCIP/ NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用Origin7.5軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、擬合和作圖。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本行配對(duì)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PD-118057對(duì)WT-hERG和WT/E637K-hERG電流幅度及通道電流激活特性的影響

2 結(jié)果

2.1 PD-118057對(duì)WT-hERG和WT/ E637K-hERG電流幅度及通道電流激活特性的影響PD-118057干預(yù)前，WT/ E637K-hERG細(xì)胞Imax較WT-hERG低（=5.15，P＜0.05），WT/E637K-hERG細(xì)胞最大尾電流幅度（Itail）也較WT-hERG低（=4.13，＜0.05）。另外，PD-118057干預(yù)WT-hERG細(xì)胞后，其Imax（=3.71，P＜0.05）及Ita（il=4.56，P＜0.05）幅度明顯增大。而PD-118057干預(yù)WT/E637K-hERG細(xì)胞前后，其Imax（=1.23，P＞0.05）及Itai（l=0.88，P＞0.05）幅度都無(wú)顯著變化。PD-118057干預(yù)前后WT-hERG和WT/E637K-hERG通道V1/2、k無(wú)顯著變化（均P＞0.05）。而PD-118057干預(yù)E637K-hERG前后均沒(méi)有檢測(cè)到Ikr電流。見(jiàn)表1。

2.2 PD-118057對(duì)hERG通道電流失活特性的影響PD-118057干預(yù)WT-hERG后使得通道穩(wěn)態(tài)失活電流的電向明顯向負(fù)向移動(dòng)（=6.45，P＜0.05），而斜率因子k無(wú)顯著變化（=2.17，P＞0.05）。而PD-118057干預(yù)WT/E637K-hERG前后V1/2和k都沒(méi)有顯著變化（=0.44、0.19，均P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 Western blot分析PD-118057干預(yù)hERG通道前后蛋白表達(dá)的變化WT-hERG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，在135和155kD可見(jiàn)兩條明顯的蛋白條帶，而轉(zhuǎn)染E637K-hERG的HEK293細(xì)胞僅在135kD可見(jiàn)蛋白條帶，而155kD的蛋白條帶缺失；轉(zhuǎn)染W(wǎng)T/E637K-hERG質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞雖然在135和155 kD也有兩條蛋白條帶，但155 kD的蛋白條

帶明顯弱于野生型細(xì)胞。PD-118057干預(yù)后未能恢復(fù)WT/E637K-hERG及E637K-hERG通道蛋白表達(dá)。見(jiàn)封四彩圖3。

3 討論

2型長(zhǎng)QT綜合征（LQT2）是由于hERG基因突變，導(dǎo)致其編碼的IK r通道電流減少，Q-T間期延長(zhǎng)，引起心律失常，甚至猝死的發(fā)生[4]。目前對(duì)LQT2患者缺乏特異性診斷及有效治療方法。因此，尋求新的有效藥物至關(guān)重要。有文獻(xiàn)據(jù)報(bào)道，一些藥物能夠恢復(fù)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，但引起hERG通道阻滯，導(dǎo)致獲得性長(zhǎng)QT綜合征的發(fā)生[5]。hERG通道已成為國(guó)外藥物安全篩查的標(biāo)準(zhǔn)。開(kāi)發(fā)新型的具有有效藥物拯救而沒(méi)有hERG通道阻滯作用的化合物至關(guān)重要。PD-118057是一類(lèi)經(jīng)典的hERG通道激活劑，對(duì)于治療LQT2具有極大的潛能，但其確切機(jī)制至今不詳。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD-118057增大hERG電流幅度而不影響離子通道特性，與Zhou等[2]研究結(jié)果相符。目前，對(duì)于PD-118057作用機(jī)制有以下幾點(diǎn)猜測(cè)[5]：（1）通過(guò)快通道失活來(lái)減少hERG電流整流，從而減慢整個(gè)hERG通道失活；（2）通過(guò)阻礙電壓感受器與選擇性濾器之間相互作用，改變通道失活；（3）通過(guò)與hERG通道結(jié)合，將選擇性濾器穩(wěn)定在開(kāi)放狀態(tài)從而導(dǎo)致Ikr電流增大。盡管目前的研究不能排除PD-118057是通過(guò)間接途徑增大hERG電流，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果間接證明PD-118057直接作用于hERG通道，增加其通道的開(kāi)放概率，從而使Ikr電流增大。另外，本實(shí)驗(yàn)顯示PD-118057不能糾正負(fù)顯性機(jī)制E637K-hERG通道功能。PD-118057增大WT-hERG通道電流，但對(duì)WT/ E637K-hERG通道電流無(wú)顯著影響，這說(shuō)明盡管WT/E637K-hERG是由WT-hERG和E637K-hERG隨機(jī)分布構(gòu)成，但突變基因能夠影響正常基因的表達(dá)，使雜合型細(xì)胞通道功能低于野生型細(xì)胞，呈現(xiàn)負(fù)顯性效應(yīng)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果與膜片鉗結(jié)果相符。正常的hERG通道生物過(guò)程包括最初由蛋白單體核心糖基化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成135kD未成熟蛋白，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，經(jīng)高爾基體復(fù)雜糖基化修飾后，運(yùn)輸至細(xì)胞膜上形成的成熟通道蛋白，從而顯現(xiàn)兩條蛋白條帶（135、155kD）。且155kD被認(rèn)為是糾正hERG通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的標(biāo)志[6]。本實(shí)驗(yàn)表明PD-118057不能恢復(fù)雜合型及突變型hERG通道的蛋白運(yùn)輸缺陷。

對(duì)hERG鉀通道藥物基因組學(xué)研究對(duì)藥物的個(gè)體化使用及新藥研究具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然不能直接應(yīng)用于臨床，但為探索新的治療負(fù)顯性機(jī)制LQT2突變提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)新型的治療LQT2藥物提供新的思路及策略。另外，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步開(kāi)展PD-118057的激動(dòng)作用是否會(huì)被突變位點(diǎn)影響，及在動(dòng)物、心肌細(xì)胞水平驗(yàn)證PD-118057的安全性及治療價(jià)值。

表2 PD-118057對(duì)WT-hERG和WT/E637K-hERG通道電流失活特性的影響

[1]Perry M,Sachse FB,Abbruzzese J,etal.PD-118057 contacts the pore helix of hERG1 channels to attenuate inactivation and enhance K+conductance[J].Proc Natl Acad SciUSA,2009,106(47):20075-20080.

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R54

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