趙 蕊 高 旭 邵興月 (黑龍江哈爾濱醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，哈爾濱 150081)

隨著人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染率的升高，宮頸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，成為嚴重危害女性健康的疾病。腫瘤細胞可通過許多途徑來逃避機體的免疫監(jiān)視，導致腫瘤免疫耐受。在對HPV 相關腫瘤的免疫監(jiān)控中，細胞毒性T 淋巴細胞發(fā)揮了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，一種導致T 細胞增殖力和活性降低的色氨酸代謝初始限速酶-吲哚胺2，3-二氧化酶(Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)能在腫瘤細胞中表達［1］，這可能是引起腫瘤免疫逃逸的重要因素之一。IDO 在腫瘤免疫逃逸中起到重要作用［2，3］。腫瘤細胞由于免疫耐受和免疫逃逸機制的存在，使機體免疫系統(tǒng)無法對腫瘤細胞進行有意義的識別和殺傷。在抗腫瘤免疫反應中，Th1 細胞主導機體的細胞免疫功能，分泌Th1 類細胞因子，對抗腫瘤免疫反應起重要的作用，而Th2 細胞分泌Th2 類細胞因子，對抗Th1 細胞的作用。IL-2、IFN-γ 主要由Th1細胞分泌，而IL-4、IL-10 是主要的Th2 類細胞因子，可抑制Th1 類細胞因子應答。IL-10 是一種免疫抑制因子，具有多種抑制抗腫瘤免疫應答的作用，IL-10 可保護腫瘤細胞免受特異性CTL 的殺傷，與腫瘤患者的預后及生存期、化療效果呈負相關，而IL-4能夠促進Th0 細胞向Th2 細胞極化，同時又是IL-10分泌的啟動因子之一。研究表明腫瘤宿主體內以Th2 類細胞因子模式占優(yōu)勢狀態(tài)，不僅表現(xiàn)在外周血淋巴細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞上，而且腫瘤宿主的脾淋巴細胞也存在Th2 類細胞因子的強勢表達［4，5］。Th2 類細胞因子呈優(yōu)勢狀態(tài)，是導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移及腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸的機制之一。

化療是腫瘤綜合治療中的主要手段之一，但是大多化療后會引起機體免疫抑制，預后不良。越來越多的研究證實，從植物中提取的多糖具有提高機體免疫力的作用，已成為免疫治療方法的理想藥物［6］。我國馬齒莧資源豐富，分布廣，其不僅具有藥用價值，還具有很高的營養(yǎng)價值。本實驗室已經對馬齒莧多糖進行了提取、分離、純化和結構鑒定，并初步證實馬齒莧多糖(POL-P3b)對人宮頸癌細胞株Hela 有很好的抑制作用［7，8］，隨著對腫瘤免疫逃逸機制的研究，本研究以荷U14 宮頸癌實體瘤小鼠為模型灌胃給藥，探討POL-P3b 免疫刺激活性，為馬齒莧進一步開發(fā)成為具有高效低毒作用的宮頸癌治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 POL-P3b 由本研究室制備并鑒定。通過水提醇沉方法獲得馬齒莧粗多糖(POLP)，POL-P 經脫蛋白、透析、凍干，上DEAE 纖維素色譜柱層析分離得POL-P1、POL-P2 和POL-P3。根據(jù)各部分的糖含量及對Hela 細胞的抑制效果，篩選POL-P3 進行后續(xù)試驗。POL-P3 經Sephadex G-200凝膠色譜柱進一步分離得到POL-P3b。POL-P3b 含有β(1→3)糖苷鍵，不含蛋白和核苷酸，由葡萄糖和半乳糖兩種單糖組成。環(huán)磷酰胺(CTX)購于山西普德制藥廠。

1.2 試驗動物和細胞株 昆明種小鼠，體重18～22 g，由協(xié)和醫(yī)院動物研究所提供。自由飲用自來水，清潔級動物飼養(yǎng)房，溫濕度適宜，光照8～10 h/d。小鼠宮頸癌U14 細胞株引自中國醫(yī)學科學院藥物研究所，在小鼠腹腔中進行傳代。

1.3 方法

1.3.1 荷小鼠U14 宮頸癌實體瘤模型的復制 建模前小鼠禁食不禁水12 h。在無菌條件下，吸取在昆明種小鼠體內傳代7～10 d 的U14 腫瘤細胞，生理鹽水調整細胞密度為5 ×106cell/ml，于小鼠左前肢腋窩皮下接種0.2 ml，接種成功率100%。

1.3.2 試驗動物的分組和處理 腫瘤接種后24 h，模型小鼠隨機分為4 組，每組10 只。分別為荷瘤對照組(生理鹽水)、POL-P3b 低劑量組(100 mg/kg)、POL-P3b 高劑量組(200 mg/kg)和陽性對照組(CTX，25 mg/kg)。POL-P3b 處理組和荷瘤對照組均采用灌胃給藥，CTX 對照組采用腹腔注射給藥，給藥劑量為人每kg 體重臨床用藥量的12 倍。所有動物每日給藥1 次，連續(xù)給藥13 d。

1.3.3 POL-P3b 對荷瘤小鼠免疫器官重量的影響末次用藥后24 h，小鼠麻醉，摘眼球取血。將麻醉小鼠進行斷頸處死，無菌條件下迅速解剖其胸腺和脾臟組織，稱重。依據(jù)下列公式計算胸腺、脾臟指數(shù):胸(脾)腺指數(shù)(mg/10g)=胸(脾)腺重量/去瘤體重×10。

1.3.4 ConA 誘導荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化試驗 參照文獻［9］方法，末次給藥24 h 后，斷頸處死各組小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's 液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細胞懸液。經200 目篩網(wǎng)過濾，用Hank's 液洗2 次，每次離心10 min(1 000 r/min)。棄上清將細胞漿彈起，加入0.5 ml 滅菌水20 s，裂解紅細胞后再加入0.5 ml 2 倍Hank’s 液及8 ml Hank’s 液，1 000 r/min，10 min 離心，用1 ml 含10%小牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)(活細胞數(shù)應在95%以上)，用臺盼蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上)，最后用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為3 ×106個/ml。將每一份脾細胞懸液分兩孔加入24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml，一孔加75 μl ConA 液，另一孔作對照，置于培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)中孵育72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔吸取上清0.7 ml，加入0.7 ml RPMI1640 培養(yǎng)液，同時加入50 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后每孔加1 ml 酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結晶溶解完全，然后分裝到96 孔培養(yǎng)板中，每孔設3 個平行孔(75 μl/孔)，570 nm 下測光密度值(Optical Density，OD)。

1.3.5 脾細胞分泌細胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4)的檢測 按1.3.4 方法獲得脾細胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為6 ×106個/ml，加入24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml。置CO2孵箱中，培養(yǎng)48 h，收集脾細胞培養(yǎng)液，離心，取上清，應用雙抗體夾心ABCELISA 檢測脾細胞培養(yǎng)液中IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-4的含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.6 免疫組化檢測POL-P3b 對腫瘤組織IDO 的表達 4 μm 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，5%H2O2甲醇溶液中，室溫震蕩10 min;抗原修復液(0.01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 6.0)，高壓抗壓熱修復法進行抗原修復2 min;山羊血清封閉，37℃，10 min;滴加一抗(兔抗鼠IDO 單克隆抗體)，37℃，30 min;二抗為生物素化羊抗兔IgG，37℃，15 min;以PBS 代替一抗作陰性對照;DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。細胞胞漿呈棕黃色者為陽性細胞。每張切片隨機取2～3 個高倍鏡視野采用HPIAS 全自動圖像分析儀進行分析，測平均光密度值反映染色深淺的程度(Mean optical density，MOD)［10］。

1.3.7 Western blot 檢測POL-P3b 處理對腫瘤組織IDO 的表達 將小鼠頸椎脫臼處死，剝離腫瘤組織，提取總蛋白，進行蛋白定量。蛋白經電泳分離后，轉移到PVDF 膜上，0.1%麗春紅染色，將帶有Marker條帶的膜剪下。用含5%脫脂奶粉的TBS-T 封閉，室溫1 h。一抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBS-T 室溫下脫色搖床上洗3 次，每次10 min。將膜與二抗(1∶3 000 結合)，室溫作用1 h，脫色搖床上洗3 次，每次10 min。采用Immobilon western 化學發(fā)光底物(HRP substrate peroxide solution 和HRP substrate lemino regent)顯像，照相保存圖片。Western blot 檢測條帶用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One 軟件掃描灰度值。計算目的蛋白與β-actin 灰度值的比值，進行統(tǒng)計學分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Origin7.5 分析軟件包進行統(tǒng)計分析，各組試驗數(shù)據(jù)以±s 表示，多組資料經方差齊性檢驗為方差齊性后，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，如組之間有差異，進行兩組間比較。P ＜0.05 有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 POL-P3b 處理對荷瘤小鼠免疫器官重量的影響 對各組小鼠進行藥物處理13 d 后，無菌條件下迅速解剖出其胸腺、脾臟組織，電子天平稱重，試驗結果見表1。結果顯示與荷瘤對照組相比，POL-P3b處理組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)增加，且高劑量優(yōu)于低劑量組(P ＜0.01，P ＜0.01)。而CTX 組則使其胸腺、脾臟指數(shù)顯著減小(P ＜0.05，P ＜0.05);與CTX組相比，POL-P3b 組的胸腺、脾臟指數(shù)顯著增加，且高劑量優(yōu)于低劑量組(P ＜0.01，P ＜0.01)。結果表明，CTX 處理能抑制胸腺、脾臟組織的發(fā)育，而POLP3b 對胸腺和脾臟組織發(fā)育有一定的促進作用。

2.2 POL-P3b 對ConA 誘導荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化試驗的影響 脾淋巴細胞轉化試驗是檢測機體細胞免疫功能的一種體外試驗，轉化率的高低可直接反映機體細胞免疫功能的高低。如表2 所示，與荷瘤對照組比，CTX 處理組小鼠的脾淋巴細胞轉化能力進一步降低，說明CTX 使荷瘤小鼠的細胞免疫力下降。POL-P3b 處理后，脾淋巴細胞轉化能力增加，細胞免疫均提高，且高劑量組效果明顯，說明POL-P3b 能提高腫瘤小鼠的細胞免疫力。

2.3 POL-P3b 處理對荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響 腫瘤的宿主脾細胞分泌的Th2 類細胞因子占優(yōu)勢，使荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的自穩(wěn)態(tài)失衡［4，5］。從表3 中可以看出，POL-P3b 能降低荷瘤小鼠脾細胞分泌的IL-4 和IL-10 水平，并能促進荷瘤小鼠脾細胞分泌的IL-2 和IFN-γ，且高劑量組效果更明顯(P ＜0.05，P ＜0.01)，表明POL-P3b 能使荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的自穩(wěn)態(tài)失衡得到糾正。CTX 處理使荷瘤宿主脾細胞分泌的IL-2 和IFN-γ 降低，IL-10 含量升高，但沒有統(tǒng)計學意義，可以看出CTX 對荷瘤宿主脾細胞分泌的細胞因子自穩(wěn)態(tài)失衡沒有改善。

表1 POL-P3b 處理對荷瘤小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of POL-P3b on thymus index and spleen index of tumor-bearing mice(±s，n=10)

表1 POL-P3b 處理對荷瘤小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of POL-P3b on thymus index and spleen index of tumor-bearing mice(±s，n=10)

Note:Compared with the control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;compared with the CTX group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

表2 POL-P3b 對ConA 誘導荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of POL-P3b on ConA inducing spleen lymphocyte transformation in tumor-bearing mice(±s，n=10)

表2 POL-P3b 對ConA 誘導荷瘤小鼠脾淋巴細胞轉化的影響(±s，n=10)Tab.2 Effects of POL-P3b on ConA inducing spleen lymphocyte transformation in tumor-bearing mice(±s，n=10)

Note:Compared with the control，1)P ＜0.05;compared with the CTX group，2)P ＜0.05.

2.4 免疫組化檢測POL-P3b 處理對腫瘤組織IDO 蛋白表達的影響 免疫組化結果顯示POLP3b 處理對腫瘤組織IDO 蛋白表達的影響見表4及圖1。與荷瘤對照組相比，CTX 和POL-P3b 組IDO 光密度值降低。高劑量POL-P3b 組效果優(yōu)于CTX 和POL-P3b 低 劑 量 組(P ＜0.01)。與CTX 組相比，高劑量POL-P3b 的IDO 光密度值降低效果明顯(P ＜0.05)。

2.5 Western blot 檢測POL-P3b 處理對腫瘤組織IDO 蛋白表達的影響 Western blot 進一步檢測POL-P3b 處理對腫瘤組織IDO 蛋白表達的影響。如圖2 所示，腫瘤組織IDO 蛋白高表達，CTX 和POLP3b 能降低IDO 蛋白表達量，且高劑量POL-P3b 效果顯著(P ＜0.01)。

表3 POL-P3b 處理對荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響(±s，n=10)Tab.3 Effects of POL-P3b on cytokines content secreted by spleen cells in tumor-bearing mice(±s，n=10)

表3 POL-P3b 處理對荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的影響(±s，n=10)Tab.3 Effects of POL-P3b on cytokines content secreted by spleen cells in tumor-bearing mice(±s，n=10)

Note:Compared with the control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;compared with the CTX group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

表4 POL-P3b 對腫瘤組織IDO 蛋白表達的影響(±s，n=10)Tab.4 Effects of POL-P3b on IDO expression in tumor tissue (±s，n=10)

表4 POL-P3b 對腫瘤組織IDO 蛋白表達的影響(±s，n=10)Tab.4 Effects of POL-P3b on IDO expression in tumor tissue (±s，n=10)

Note:Compared with the control，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;compared with the CTX group，3)P ＜0.05.

圖1 免疫組化檢測POL-P3b 對腫瘤組織IDO 蛋白的影響Fig.1 Effects of POL-P3b on IDO expression detected by immunohistochemistry in tumor tissue

圖2 POL-P3b 處理對腫瘤組織IDO 蛋白的表達量Fig.2 Level of POL-P3b on IDO expression in tumor tissue

3 討論

環(huán)磷酰胺是臨床常用的腫瘤抑制劑，但是其在殺傷腫瘤細胞的同時可損傷機體的免疫器官，抑制機體的體液免疫和細胞免疫［11］。多糖是一重要的活性物質，細胞毒性小，因其抑制腫瘤生長已越來越被人們所重視。多糖治療腫瘤不是直接殺傷腫瘤細胞，而是作為一種生物反應調節(jié)劑，促進細胞和體液免疫反應，來達到抑制和消滅腫瘤細胞的效果［12］。所以尋找高效的生物反應調節(jié)劑是當今腫瘤免疫治療的主要方向之一。馬齒莧在我國資源豐富，儲量大且無污染，它不但具有一定的營養(yǎng)保健作用，且具有多種藥理活性，被譽為21 世紀最有發(fā)展的綠色食物之一。隨著醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，馬齒莧越來越引起科研工作者的興趣，并日益增進了對馬齒莧藥用價值的認識。馬齒莧多糖(POL-P3b)具有一定的抗腫瘤作用［13］，但是其抗腫瘤的機制研究較少。本課題組在對POL-P3b 藥理活性的研究中發(fā)現(xiàn)POLP3b 具有抑制宮頸癌的作用［7，8］，在此基礎上本文進一步證明了其對荷瘤小鼠的免疫調節(jié)作用。

胸腺與脾臟作為機體的主要免疫器官，它們的重量改變可反映出受試藥物對免疫系統(tǒng)的刺激作用。本試驗結果表明，POL-P3b 能夠增加荷瘤小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，從而增強小鼠免疫器官的功能，且高劑量優(yōu)于低劑量(表1，P ＜0.01)。脾淋巴細胞轉化試驗是檢測機體細胞免疫功能的一種體外試驗，轉化率的高低可直接反映機體細胞免疫功能的高低。試驗結果表明，POL-P3b 能夠增強小鼠機體免疫器官對異物的吞噬能力且能提高腫瘤小鼠的細胞免疫力(表2，P ＜0.05)。

輔助性T 細胞(helper T lymphocyte，Th)是機體重要的免疫調節(jié)細胞，其中Th1 細胞主要分泌IL-2、腫瘤壞死因子-α 等，而Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-10、轉化生長因子-β1 等［14］。Th1 型細胞因子可以增強殺傷細胞的細胞毒作用，主要介導細胞免疫應答，細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要形式;Th2 型細胞因子可促進抗體產生，主要介導體液免疫反應。腫瘤患者處于Th2 細胞優(yōu)勢的分化狀態(tài)，其產生的細胞因子對Th1 細胞增殖分化和細胞毒性T 淋巴細胞的功能具有抑制作用，從而導致機體抗腫瘤免疫功能減弱，使腫瘤發(fā)免疫耐受，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉歸中起著重要的作用［4］。正常機體的Th1/Th2 型細胞因子處于動態(tài)平衡，對維持機體正常的免疫功能至關重要。當Th1/Th2 型細胞因子的平衡失調，會導致機體免疫調節(jié)功能的紊亂，引起異常的免疫應答。本研究選擇IL-2、IFN-γ 代表Th1 類細胞因子，IL-4、IL-10代表Th2 細胞因子，通過檢測荷宮頸癌小鼠脾細胞分泌Th1/Th2 類細胞因子，探討POL-P3b 對荷瘤小鼠細胞免疫功能的調節(jié)作用。本試驗表明荷瘤小鼠Th2 型細胞因子占優(yōu)勢(表3)，POL-P3b 能使荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的自穩(wěn)態(tài)失衡得到糾正。POL-P3b 能降低荷瘤小鼠脾細胞分泌的IL-4 和IL-10 水平，并能促進荷瘤小鼠脾細胞分泌的IL-2 和IFN-γ，且高劑量組效果更明顯(P ＜0.01)。IL-10 是抑制Th1 型細胞應答和介導Th2型細胞發(fā)育的主要細胞因子，可使細胞免疫應答進一步受到抑制。Th1 型細胞因子占優(yōu)勢可增強抗腫瘤免疫反應，其中IL-2 刺激自然殺傷細胞或細胞毒性T 淋巴細胞的殺瘤活性。CTX 處理使荷瘤宿主脾細胞分泌的IL-2 和IFN-γ 降低，IL-10 含量升高，可以看出CTX 對荷瘤宿主脾細胞分泌的細胞因子自穩(wěn)態(tài)失衡沒有改善。

腫瘤在生長的同時能構成一個幫助腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視的微環(huán)境。宮頸癌在發(fā)生發(fā)展的過程中由于HPV 感染可產生細胞調節(jié)因子IL-10，而IL-10 能在轉錄水平誘導IDO 表達，促使腫瘤免疫逃逸［15，16］，這可能是腫瘤細胞難以誘導有效免疫應答的重要因素之一。目前認為IDO 在許多腫瘤細胞系中表達是因為IFN-γ 和其他炎癥介質的誘導作用，IDO 表達和炎癥密切相關。IDO 可能是腫瘤細胞或宿主間質細胞用來抵抗來自宿主抗腫瘤反應的炎性細胞因子［17］。本研究通過免疫組化和Western blot 兩種方法檢測POL-P3b 對荷瘤小鼠腫瘤組織中IDO 表達的影響，結果顯示CTX 和POLP3b 均能抑制腫瘤組織中IDO 的表達，但高劑量POL-P3b 效果更明顯(表4，圖2，P ＜0.01)。前面結果也表明POL-P3b 能促進荷瘤小鼠脾細胞分泌IFN-γ，而IFN-γ 又是IDO 誘導因子，這種矛盾的產生有待進一步研究闡明。綜上所述，POL-P3b 能提高荷瘤小鼠的細胞免疫，能使荷瘤小鼠脾細胞分泌細胞因子的自穩(wěn)態(tài)失衡得到糾正。通過抑制腫瘤組織中IDO 的表達改善腫瘤的免疫逃逸。

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