姜 暉 陳霞霞 王金艷 薛云飛 (河北省唐山市工人醫(yī)院藥劑科，唐山 063000)

支氣管哮喘是一種慢性的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重威脅人類的健康［1，2］。近年來，支氣管哮喘在世界各國的發(fā)病率均有上升，且兒童的哮喘患病率也逐年攀升，支氣管哮喘已逐漸成為嚴重危害成人與兒童健康的公共衛(wèi)生問題。但是目前的研究尚未能完全闡明哮喘的發(fā)病機制［3，4］。研究表明，支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞以及T 淋巴細胞等多種細胞共同參與的一種氣道炎癥。各種細胞在氣道內聚集，進而釋放細胞因子以及炎癥介質引起氣道功能發(fā)生障礙。而T 淋巴細胞在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。Th17 細胞以及Treg 細胞是獨立的CD4+T 細胞亞群，Th17 細胞主要通過分泌IL-17來發(fā)揮免疫作用，在炎性反應以及免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。而Treg 細胞通過與其他細胞直接接觸和/或分泌一些抑制性的細胞因子如TGF-β、IL-10 等發(fā)揮免疫負調控的作用［5］，通過Treg 細胞功能的發(fā)揮，可以控制效應T 細胞的反應強度，從而防止過度免疫反應對機體造成的病理損害。

川芎嗪是一種在臨床應用已久的中藥，其具有作用靶點多、副作用小，在治療哮喘方面療效確切的優(yōu)點［6，7］，但是其在哮喘中的作用機制尚不清楚［8，9］，本研究通過建立小鼠哮喘模型，觀察川芎嗪對小鼠Th17、Treg 細胞的影響，探討川芎嗪在治療哮喘中的機制，以期進一步為臨床治療哮喘提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物以及動物模型建立 雄性BALB/c 小鼠40 只，6～8 周齡，體重為22～24 g。隨機將小鼠分成四組，分別為正常對照組、哮喘模型組、川芎嗪治療組以及激素治療組，其中哮喘模型組、川芎嗪治療組以及激素治療組在第0、7、14 天給予含0.1%OVA 的0.1 ml Al(OH)3腹腔注射，并在第21 天開始用含2%的OVA 生理鹽水溶液10 ml 進行霧化吸入30 min;川芎嗪治療組小鼠在第0、7、14 天以及每次霧化吸入前30 min 腹腔注射川芎嗪80 mg/kg;激素治療組小鼠在第0、7、14 天以及每次霧化吸入前30 min 腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg;正常對照組用生理鹽水替代OVA 進行腹腔注射以及霧化吸入。

1.2 標本收集 眼球取血后處死小鼠，取200 μl加PBS 稀釋至3 ml，緩慢加入至小鼠淋巴細胞分離液上，保持分層，4℃、1 500 r/min、10 min，取中間白色的淋巴細胞層，用3 ml PBS 重懸后離心，棄上清。其余的血液靜置2 h 后離心，4℃、2 000 r/min、15 min，取上層血清分裝保管于-80℃冰箱。解剖小鼠后，取左下肺葉，用10%的甲醛固定后，脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE 染色。

1.3 ELISA 測定血清中IL-17、IL-10 的水平 按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測血清中IL-17、IL-10的水平，用酶標儀在450nm 處測定OD 值。

1.4 流式細胞儀檢測Th17 細胞、Treg 細胞比例 心臟灌洗后取小鼠肺組織剪成約3 cm ×2 cm 的小塊，用IV 型膠原酶在37℃消化3 h，過膜后4℃、2 750 r/min× g，7 min，percoll 離心，棄上清，加入40%細胞后，4℃、2 000 r/min，20 min，取中間的一層細胞用PBS 洗2 遍，離心棄上清后計數取稀釋的細胞懸液，每管含1 ×106個細胞，分別加入CD4、CD25、IL-17 抗體或者CD4、CD25 抗體，破膜固定后加入FoxP3 抗體，混勻后避光孵育30 min，加3 ml PBS，4℃、1 500 r/min、5 min，棄上清，用500 μl 2%的多聚甲醛固定后待測。

1.5 統(tǒng)計學分析 數據采用SPSS11.5 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量數據用±s 表示，組間比較采用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組小鼠的癥狀觀察 在每次致敏和霧化吸入后，觀察四組小鼠的癥狀，發(fā)現在第1 次致敏后，各組小鼠表現無差異。在第2 次致敏后，哮喘模型組、川芎嗪治療組及激素治療組小鼠出現伏地不動和毛發(fā)豎起的現象，而正常對照組小鼠未發(fā)現上述現象。在霧化吸入后，哮喘模型組小鼠出現呼吸急促、鼻翼煽動、煩躁不安、反應遲鈍、排泄物增多等現象。川芎嗪治療組及激素治療組小鼠表現較輕微，僅有活動減慢、精神輕度萎靡的現象，正常對照組小鼠活動良好。

2.2 四組小鼠的肺組織病理檢查 各組小鼠組織切片HE 染色后在光鏡下觀察發(fā)現，正常對照組小鼠肺部紋理致密，未見炎癥細胞。哮喘模型組小鼠支氣管管腔變小，管壁增厚，并且肺泡間隙增寬，在支氣管和小血管周圍發(fā)現大量的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤。而治療組小鼠的肺組織切片中僅發(fā)現少量的炎性細胞，見圖1。

2.3 四組小鼠外周血中Th17 細胞以及Treg 細胞比例 通過流式細胞儀分析四組小鼠外周血中Th17 細胞和Treg 細胞占總CD4+T 細胞的比例發(fā)現，正常對照組小鼠的Treg 細胞以及Th17 細胞的比例為正常范圍，哮喘模型組小鼠的Treg 細胞較正常組小鼠比例明顯降低，而Th17 細胞占CD4+T 細胞顯著升高;川芎嗪治療組小鼠以及激素治療組小鼠的變化趨勢一致，Treg 細胞以及Th17 細胞的比例趨于正常，見圖2、3。

2.4 ELISA 測定血清中IL-17、IL-10 的水平 IL-17是Th17 細胞主要分泌的細胞因子，而IL-10 是Treg細胞發(fā)揮抑制作用的主要細胞因子。通過ELISA法檢測各組小鼠血清中的IL-17、IL-10 的水平，發(fā)現正常對照組小鼠血清中IL-17 以及IL-10 的水平在正常范圍內，分別為(10.21±2.11)、(57.37±3.29)ng/ml，而哮喘模型組小鼠的IL-17 的水平達到了(23.6±2.19)ng/ml 顯著高于正常對照組小鼠(t=13.283，P=0.000)，IL-10 的水平為(17.38±4.62)ng/ml 較正常對照組小鼠顯著降低(t=11.748，P=0.000)，川芎嗪治療組小鼠的IL-17 水平為16.22±2.37 ng/ml 較哮喘模型組小鼠明顯降低(t=9.462，P=0.000)，而IL-10 的水平為40.27±1.28 ng/ml顯著升高(t=11.374，P=0.000)，激素治療組小鼠的變化趨勢與川芎嗪治療組小鼠一致，見圖4。

圖1 四組小鼠的肺組織HE 染色(光學顯微鏡，×200)Fig.1 Mice lung tissue HE staining of four groups(Optical microscope，×200)

圖2 Treg 細胞以及Th17 細胞占CD4 +T 細胞比例的流式圖Fig.2 Flow chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

圖3 Treg 細胞以及Th17 細胞占CD4 +T 細胞比例的統(tǒng)計圖Fig.3 Statistical chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

圖4 血清中IL-17、IL-10 的水平Fig.4 Level of serum IL-10 and IL-17

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的以氣道高反應性和可逆性氣道阻塞為主要特征的變態(tài)反應性疾病。支氣管哮喘會導致氣道反應增高，氣道黏膜細胞會分泌大量的黏液，出現不可逆的氣流受限［10］。在支氣管哮喘的病理過程中，有多種細胞如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞以及T 淋巴細胞等都參與了炎癥反應。研究表明，氣道的高反應性與Th1 細胞受到抑制以及Th2 細胞功能亢進有關［11，12］，但是近年來的研究發(fā)現，Th1 細胞與Th2 細胞的失衡不能解釋所有的發(fā)病機制。大量的研究表明，Th17 細胞和Treg 細胞在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用［13］。

川芎嗪是一種從中藥川芎中提取出來的一種生物堿，川芎嗪有活血化瘀、祛風止痛、行氣的功效。研究發(fā)現，川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可以明顯抑制不同因素引起的平滑肌細胞的鈣離子內流，可能與影響氣道重建有關［14，15］。研究發(fā)現在豚鼠的哮喘模型中，川芎嗪可以提高外周血中Treg 細胞的比例，對由Th2 細胞介導的呼吸道變應性炎癥發(fā)揮強大的抑制效應。本研究結果顯示川芎嗪能夠明顯地減少OVA 誘導哮喘小鼠模型肺組織中Th17 細胞占CD4+T 細胞的比例以及IL-17 的表達水平，其機制可能是通過促進Treg 細胞的生長、增殖以及IL-10等抑制性細胞因子的分泌預防或控制哮喘的發(fā)生。

本研究設立了生理鹽水誘導的正常小鼠作為陰性對照組，致敏原OVA 誘導的哮喘模型組，川芎嗪治療的小鼠以及激素治療的陽性對照組。通過觀察小鼠的癥狀、肺組織的病理圖片以及各組小鼠外周血中Th17 細胞以及Treg 細胞比例以及血清中IL-17、IL-10 的水平，發(fā)現小鼠哮喘模型的Treg 細胞受到明顯抑制而Th17 細胞的比例升高，誘導過程中給予川芎嗪及地塞米松治療組，可以有效地阻止這種變化，從而減輕哮喘的癥狀，預防/控制哮喘發(fā)生，為有效控制支氣管哮喘發(fā)作提供有效的治療途徑。

本研究結果提示川芎嗪可以通過增強Treg 細胞的功能，增加Treg 細胞的數量，進而抑制Th17 細胞的數量以及功能，減輕Th17 細胞的應答，降低IL-17 細胞因子的分泌，達到預防/控制哮喘發(fā)生、減輕哮喘癥狀的療效。

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