姜 暉 陳霞霞 王金艷 薛云飛 (河北省唐山市工人醫(yī)院藥劑科，唐山 063000)

支氣管哮喘是一種慢性的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅人類的健康［1，2］。近年來，支氣管哮喘在世界各國的發(fā)病率均有上升，且兒童的哮喘患病率也逐年攀升，支氣管哮喘已逐漸成為嚴(yán)重危害成人與兒童健康的公共衛(wèi)生問題。但是目前的研究尚未能完全闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制［3，4］。研究表明，支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及T 淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞共同參與的一種氣道炎癥。各種細(xì)胞在氣道內(nèi)聚集，進(jìn)而釋放細(xì)胞因子以及炎癥介質(zhì)引起氣道功能發(fā)生障礙。而T 淋巴細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。Th17 細(xì)胞以及Treg 細(xì)胞是獨(dú)立的CD4+T 細(xì)胞亞群，Th17 細(xì)胞主要通過分泌IL-17來發(fā)揮免疫作用，在炎性反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。而Treg 細(xì)胞通過與其他細(xì)胞直接接觸和/或分泌一些抑制性的細(xì)胞因子如TGF-β、IL-10 等發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控的作用［5］，通過Treg 細(xì)胞功能的發(fā)揮，可以控制效應(yīng)T 細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，從而防止過度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成的病理損害。

川芎嗪是一種在臨床應(yīng)用已久的中藥，其具有作用靶點(diǎn)多、副作用小，在治療哮喘方面療效確切的優(yōu)點(diǎn)［6，7］，但是其在哮喘中的作用機(jī)制尚不清楚［8，9］，本研究通過建立小鼠哮喘模型，觀察川芎嗪對(duì)小鼠Th17、Treg 細(xì)胞的影響，探討川芎嗪在治療哮喘中的機(jī)制，以期進(jìn)一步為臨床治療哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及動(dòng)物模型建立 雄性BALB/c 小鼠40 只，6～8 周齡，體重為22～24 g。隨機(jī)將小鼠分成四組，分別為正常對(duì)照組、哮喘模型組、川芎嗪治療組以及激素治療組，其中哮喘模型組、川芎嗪治療組以及激素治療組在第0、7、14 天給予含0.1%OVA 的0.1 ml Al(OH)3腹腔注射，并在第21 天開始用含2%的OVA 生理鹽水溶液10 ml 進(jìn)行霧化吸入30 min;川芎嗪治療組小鼠在第0、7、14 天以及每次霧化吸入前30 min 腹腔注射川芎嗪80 mg/kg;激素治療組小鼠在第0、7、14 天以及每次霧化吸入前30 min 腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg;正常對(duì)照組用生理鹽水替代OVA 進(jìn)行腹腔注射以及霧化吸入。

1.2 標(biāo)本收集 眼球取血后處死小鼠，取200 μl加PBS 稀釋至3 ml，緩慢加入至小鼠淋巴細(xì)胞分離液上，保持分層，4℃、1 500 r/min、10 min，取中間白色的淋巴細(xì)胞層，用3 ml PBS 重懸后離心，棄上清。其余的血液靜置2 h 后離心，4℃、2 000 r/min、15 min，取上層血清分裝保管于-80℃冰箱。解剖小鼠后，取左下肺葉，用10%的甲醛固定后，脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE 染色。

1.3 ELISA 測(cè)定血清中IL-17、IL-10 的水平 按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)血清中IL-17、IL-10的水平，用酶標(biāo)儀在450nm 處測(cè)定OD 值。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞比例 心臟灌洗后取小鼠肺組織剪成約3 cm ×2 cm 的小塊，用IV 型膠原酶在37℃消化3 h，過膜后4℃、2 750 r/min× g，7 min，percoll 離心，棄上清，加入40%細(xì)胞后，4℃、2 000 r/min，20 min，取中間的一層細(xì)胞用PBS 洗2 遍，離心棄上清后計(jì)數(shù)取稀釋的細(xì)胞懸液，每管含1 ×106個(gè)細(xì)胞，分別加入CD4、CD25、IL-17 抗體或者CD4、CD25 抗體，破膜固定后加入FoxP3 抗體，混勻后避光孵育30 min，加3 ml PBS，4℃、1 500 r/min、5 min，棄上清，用500 μl 2%的多聚甲醛固定后待測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s 表示，組間比較采用方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠的癥狀觀察 在每次致敏和霧化吸入后，觀察四組小鼠的癥狀，發(fā)現(xiàn)在第1 次致敏后，各組小鼠表現(xiàn)無差異。在第2 次致敏后，哮喘模型組、川芎嗪治療組及激素治療組小鼠出現(xiàn)伏地不動(dòng)和毛發(fā)豎起的現(xiàn)象，而正常對(duì)照組小鼠未發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。在霧化吸入后，哮喘模型組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、鼻翼煽動(dòng)、煩躁不安、反應(yīng)遲鈍、排泄物增多等現(xiàn)象。川芎嗪治療組及激素治療組小鼠表現(xiàn)較輕微，僅有活動(dòng)減慢、精神輕度萎靡的現(xiàn)象，正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)良好。

2.2 四組小鼠的肺組織病理檢查 各組小鼠組織切片HE 染色后在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠肺部紋理致密，未見炎癥細(xì)胞。哮喘模型組小鼠支氣管管腔變小，管壁增厚，并且肺泡間隙增寬，在支氣管和小血管周圍發(fā)現(xiàn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。而治療組小鼠的肺組織切片中僅發(fā)現(xiàn)少量的炎性細(xì)胞，見圖1。

2.3 四組小鼠外周血中Th17 細(xì)胞以及Treg 細(xì)胞比例 通過流式細(xì)胞儀分析四組小鼠外周血中Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞占總CD4+T 細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠的Treg 細(xì)胞以及Th17 細(xì)胞的比例為正常范圍，哮喘模型組小鼠的Treg 細(xì)胞較正常組小鼠比例明顯降低，而Th17 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞顯著升高;川芎嗪治療組小鼠以及激素治療組小鼠的變化趨勢(shì)一致，Treg 細(xì)胞以及Th17 細(xì)胞的比例趨于正常，見圖2、3。

2.4 ELISA 測(cè)定血清中IL-17、IL-10 的水平 IL-17是Th17 細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子，而IL-10 是Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的主要細(xì)胞因子。通過ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中的IL-17、IL-10 的水平，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組小鼠血清中IL-17 以及IL-10 的水平在正常范圍內(nèi)，分別為(10.21±2.11)、(57.37±3.29)ng/ml，而哮喘模型組小鼠的IL-17 的水平達(dá)到了(23.6±2.19)ng/ml 顯著高于正常對(duì)照組小鼠(t=13.283，P=0.000)，IL-10 的水平為(17.38±4.62)ng/ml 較正常對(duì)照組小鼠顯著降低(t=11.748，P=0.000)，川芎嗪治療組小鼠的IL-17 水平為16.22±2.37 ng/ml 較哮喘模型組小鼠明顯降低(t=9.462，P=0.000)，而IL-10 的水平為40.27±1.28 ng/ml顯著升高(t=11.374，P=0.000)，激素治療組小鼠的變化趨勢(shì)與川芎嗪治療組小鼠一致，見圖4。

圖1 四組小鼠的肺組織HE 染色(光學(xué)顯微鏡，×200)Fig.1 Mice lung tissue HE staining of four groups(Optical microscope，×200)

圖2 Treg 細(xì)胞以及Th17 細(xì)胞占CD4 +T 細(xì)胞比例的流式圖Fig.2 Flow chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

圖3 Treg 細(xì)胞以及Th17 細(xì)胞占CD4 +T 細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Statistical chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

圖4 血清中IL-17、IL-10 的水平Fig.4 Level of serum IL-10 and IL-17

3 討論

支氣管哮喘是一種常見的以氣道高反應(yīng)性和可逆性氣道阻塞為主要特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。支氣管哮喘會(huì)導(dǎo)致氣道反應(yīng)增高，氣道黏膜細(xì)胞會(huì)分泌大量的黏液，出現(xiàn)不可逆的氣流受限［10］。在支氣管哮喘的病理過程中，有多種細(xì)胞如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及T 淋巴細(xì)胞等都參與了炎癥反應(yīng)。研究表明，氣道的高反應(yīng)性與Th1 細(xì)胞受到抑制以及Th2 細(xì)胞功能亢進(jìn)有關(guān)［11，12］，但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Th1 細(xì)胞與Th2 細(xì)胞的失衡不能解釋所有的發(fā)病機(jī)制。大量的研究表明，Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用［13］。

川芎嗪是一種從中藥川芎中提取出來的一種生物堿，川芎嗪有活血化瘀、祛風(fēng)止痛、行氣的功效。研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪是一種鈣離子拮抗劑，可以明顯抑制不同因素引起的平滑肌細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流，可能與影響氣道重建有關(guān)［14，15］。研究發(fā)現(xiàn)在豚鼠的哮喘模型中，川芎嗪可以提高外周血中Treg 細(xì)胞的比例，對(duì)由Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的呼吸道變應(yīng)性炎癥發(fā)揮強(qiáng)大的抑制效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示川芎嗪能夠明顯地減少OVA 誘導(dǎo)哮喘小鼠模型肺組織中Th17 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞的比例以及IL-17 的表達(dá)水平，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)Treg 細(xì)胞的生長、增殖以及IL-10等抑制性細(xì)胞因子的分泌預(yù)防或控制哮喘的發(fā)生。

本研究設(shè)立了生理鹽水誘導(dǎo)的正常小鼠作為陰性對(duì)照組，致敏原OVA 誘導(dǎo)的哮喘模型組，川芎嗪治療的小鼠以及激素治療的陽性對(duì)照組。通過觀察小鼠的癥狀、肺組織的病理圖片以及各組小鼠外周血中Th17 細(xì)胞以及Treg 細(xì)胞比例以及血清中IL-17、IL-10 的水平，發(fā)現(xiàn)小鼠哮喘模型的Treg 細(xì)胞受到明顯抑制而Th17 細(xì)胞的比例升高，誘導(dǎo)過程中給予川芎嗪及地塞米松治療組，可以有效地阻止這種變化，從而減輕哮喘的癥狀，預(yù)防/控制哮喘發(fā)生，為有效控制支氣管哮喘發(fā)作提供有效的治療途徑。

本研究結(jié)果提示川芎嗪可以通過增強(qiáng)Treg 細(xì)胞的功能，增加Treg 細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而抑制Th17 細(xì)胞的數(shù)量以及功能，減輕Th17 細(xì)胞的應(yīng)答，降低IL-17 細(xì)胞因子的分泌，達(dá)到預(yù)防/控制哮喘發(fā)生、減輕哮喘癥狀的療效。

［1］羅谷容.支氣管哮喘護(hù)理進(jìn)展［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2002，24(7):1031-1034.

［2］Murata A，Ling PM.Asthma diagnosis and management［J］.Emerg Med Clin North Am，2012，30(2):203-222.

［3］Passalacqua G.Specific immunotherapy:beyond the clinical scores［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2011，107(5):401-406.

［4］Uhm TG，Kim BS，Chung IY.Eosinophil development，regulation of eosinophil-specific genes，and role of eosinophils in the pathogenesis of asthma［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2012，4(2):68-79.

［5］Tatler AL，John AE，Jolly L，et al.Integrin alphavbeta5-mediated TGF-beta activation by airway smooth muscle cells in asthma［J］.J Immunol，2011，187(11):6094-6107.

［6］Zhang XP，Jiang J，Cheng QH，et al.Protective effects of Ligustrazine，Kakonein and Panax Notoginsenoside on the small intestine and immune organs of rats with severe acute pancreatitis［J］.Hepatobiliary Pancreatic Dis Int，2011，10(6):632-637.

［7］王文建，楊 莉，王西華，等.川芎嗪對(duì)哮喘大鼠氣道壁嗜酸細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)化生長因子-β1 表達(dá)的影響［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，10:716-718.

［8］Ren M，Dong J，Xu Y，et al.Synthesis of novel ligustrazine derivatives as NA +/H+exchange inhibitors［J］.Chem Biodivers，2010，7(11):2727-2736.

［9］Xue Y，Tie CR，Li J，et al.Ligustrazine inhibits lipopolysaccharideinduced proliferation by affecting P27，Bcl-2 expression in rat mesangial cells［J］.Eur J Pharmacol，2011，665(1-3):8-12.

［10］梁秀云，蒙春華，莫誠航，等.支氣管哮喘患者血清IL-4、TNF-α 及IgE 水平變化及臨床意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(20):3864-3866，3884.

［11］Oliphant CJ，Barlow JL，McKenzie AN.Insights into the initiation of type 2 immune responses［J］.Immunology，2011，134(4):378-385.

［12］魏文君.川芎嗪對(duì)哮喘患者白介素-4、干擾素-γ 的影響及對(duì)Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡失調(diào)的干預(yù)作用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(5):743-745.

［13］Shi YH，Shi GC，Wan HY，et al.Coexistence of Th1/Th2 and Th17/Treg imbalances in patients with allergic asthma［J］.Chin Med J，2011，124(13):1951-1956.

［14］Che XW，Zhang Y，Wang H，et al.Effect of ligustrazine injection on levels of interleukin-4 and interferon-gamma in patients with bronchial asthma［J］.Chin J Integr Med，2008，14(3):217-220.

［15］Xiong L，F(xiàn)ang ZY，Tao XN，et al..Effect and mechanism of ligustrazine on Th1/Th2 cytokines in a rat asthma model［J］.Am J Chin Med，2007，35(6):1011-1120.