刁毅楊足君

（1.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054；2.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 干熱河谷特色生物資源開發(fā)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，攀枝花 617000）

地木耳中脂溶性物質(zhì)抑菌活性研究

刁毅1，2楊足君1

（1.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054；2.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院 干熱河谷特色生物資源開發(fā)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，攀枝花 617000）

采用索氏提取法從地木耳中提取脂溶性物質(zhì)，經(jīng)硅膠柱層析將脂溶性物質(zhì)分離成石油醚洗脫組分（非極性脂）、苯洗脫組分（弱極性脂）和乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂），并對(duì)脂溶性物質(zhì)和3種洗脫組分進(jìn)行抑菌活性研究，以促進(jìn)地木耳的綜合應(yīng)用。結(jié)果表明，地木耳中脂溶性物質(zhì)含量為2.62%。其中，非極性石油醚洗脫組分含量最高，占總脂的54%，但無抑菌活性；強(qiáng)極性的乙醇洗脫組分含量其次，占總脂的32%，其抑菌活性最強(qiáng)；弱極性苯洗脫組分含量最低，占總脂的14%，有弱抑菌活性。地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)6種菌有較好的抑制作用，其抑制能力大小為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞黑曲霉＞釀酒酵母＞假單胞桿菌。

地木耳 脂溶性物質(zhì) 抑菌活性

地木耳又叫地皮菜、地耳、地軟等，屬藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、念珠藻目、念珠藻屬藻類。地木耳營(yíng)養(yǎng)成分豐富，蛋白質(zhì)含量為14.6%-21.81%，糖類含量為0.52%-23.8%，粗脂肪含量為0.2%-4.28%，還含有豐富的微量元素、氨基酸、維生素等，具有一定的食用性和藥用性［1，2］。

地木耳中不同組分有一定的抑菌作用。錢森和等［3］報(bào)道，地木耳提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、

啤酒酵母等具有較好的抑制作用。張?zhí)苽サ龋?］報(bào)道，地木耳提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌具有一定的抑制作用，但對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用不明顯。厲榮玉等［5］報(bào)道，地木耳中黃酮具有一定的抑菌作用。張希等［6］報(bào)道，脂肪酸具有一定的抑菌作用，不同類型的脂肪酸抑菌作用有差異。江志利［7］和張國(guó)珍［8］等報(bào)道，植物中揮發(fā)油具有普遍的殺菌作用。但地木耳中脂溶性物質(zhì)的抑菌活性還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以野生地木耳為材料，用索氏提取法提取地木耳脂溶性物質(zhì)，并分析其抑菌作用，旨在為地木耳的綜合應(yīng)用研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用地木耳材料采自四川省南部縣（N31，E106）。

試驗(yàn)所用菌株有：（1）革蘭氏陽性菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisCohn）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus Rosenbach）；（2）革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coliCastellaniet Chalmers）、假單胞桿菌（Pseudomonas stutzeri）；（3）真菌：黑曲霉（Asparagillus nigerV. Tiegh）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeHansen）。菌種保存于微生物實(shí)驗(yàn)室-80℃低溫冰箱中，試驗(yàn)前活化使用。

1.2 方法

1.2.1 地木耳中脂溶性物質(zhì)的提取及溶液制備 采用索氏提取法提取地木耳脂溶性物質(zhì)。將地木耳清洗、去除雜質(zhì)、晾干，移至80℃烘箱烘干，最后用研缽研成粉末保存?zhèn)溆?。稱取研磨好的地木耳粉末30 g，以無水乙醚為溶劑在索氏抽提瓶中在65℃下抽提1 h，蒸干溶劑，低溫干燥，稱重，獲得地木耳脂溶性物，計(jì)算地木耳中脂溶性物質(zhì)的含量。在地木耳脂溶性物質(zhì)中加入吐溫20，配制成250 mg/mL的溶液，保存于4℃冰箱中，用于抑菌試驗(yàn)。

1.2.2 脂溶性物質(zhì)中不同極性脂的分離及抑菌活性測(cè)定 將所提取的地木耳脂溶性物質(zhì)用60型硅膠柱層析分離，先后以石油醚、苯、乙醇為溶劑進(jìn)行洗脫［9］。根據(jù)脂溶性物質(zhì)的極性差異，分離獲得石油醚洗脫組分（非極性脂）、苯洗脫組分（弱極性脂）和乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）。

對(duì)不同組分稱重，分別加入石油醚、苯、乙醇配制成10 mg/mL的溶液，保存于4℃的冰箱中，用于抑菌試驗(yàn)。

1.2.3 菌種的活化與菌懸液制備 在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和假單胞桿菌菌株，在37℃下培養(yǎng)24 h，活化后接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)48 h，制成1×106CFU/mL的菌懸液，備用。

在PDA培養(yǎng)基上接種黑曲霉和釀酒酵母，在28℃下培養(yǎng)48 h，活化后接種于PDA培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)4 d，制成1×106CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2.4 地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)不同菌株的抑制作用 采用濾紙片法［10］，用打孔器將濾紙打成直徑5 mm圓形濾紙片，滅菌，備用。分別放入濃度為0.20、1、5、25和125 mg/mL的地木耳脂溶物溶液中，浸泡30 min，50℃下烘干，用無菌鑷子夾取濾紙片貼于涂布有50 μL菌懸液的平板表面，輕輕按壓，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑；真菌在28℃下培養(yǎng)，48 h后測(cè)定抑菌圈直徑。以吐溫20作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算抑制率：

抑菌率（%）=（X1-X2）/X1×100%

其中，X1為樣品抑菌圈直徑，X2為對(duì)照抑菌圈直徑。

以地木耳脂溶性物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，獲得抑制率坐標(biāo)圖，計(jì)算脂溶性物質(zhì)對(duì)不同菌的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.5 地木耳脂溶性物質(zhì)最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 按張雪松等［11］報(bào)道的方法，在培養(yǎng)基凝固前，在培養(yǎng)基中加入一定量的地木耳脂溶性物，混合均勻，使培養(yǎng)基中包含一定量的地木耳脂溶物。在培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基表面劃線接種細(xì)菌，37℃下培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況；涂布法接種真菌菌懸液，28℃下培養(yǎng)72 h，觀察生長(zhǎng)情況。用吐溫20作對(duì)照，重復(fù)3次。無菌生長(zhǎng)的脂溶物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果

2.1 地木耳中脂溶性物質(zhì)含量及成分測(cè)定

30 g地木耳干體粉末經(jīng)索氏提取，共獲得脂溶物0.786 g，占地木耳干重的2.62%。其中，石油醚

洗脫組分（非極性脂）含0.424 g，占總脂的54%；苯洗脫組分（弱極性脂）含0.11 g，占總脂的14%；乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）含0.252 g，占總脂的32%。在地木耳脂溶性物質(zhì)組分中，以非極性石油醚洗脫脂為主；其次為強(qiáng)極性乙醇洗脫脂，含量最少的為弱極性苯洗脫脂。

2.2 地木耳脂溶性物質(zhì)各組分抑菌活性

從表1可以看出，地木耳脂溶性物質(zhì)、苯洗脫組分（弱極性脂）、乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母和假單胞桿菌具有抑菌作用；乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）抑菌作用最強(qiáng)，苯洗脫組分（弱極性脂）抑菌作用次之，地木耳脂溶性物質(zhì)抑菌作用最小，石油醚洗脫組分（非極性脂）對(duì)菌株抑菌作用不敏感。

地木耳脂溶性物質(zhì)、苯洗脫組分（弱極性脂）和乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）對(duì)6種菌抑菌作用中，抑菌圈直徑最大的是大腸桿菌，直徑最小的是假單胞桿菌。說明其對(duì)大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)假單胞桿菌抑菌作用最弱。

表1 地木耳脂溶性物質(zhì)不同組分抑菌活性研究

2.3 地木耳脂溶性物質(zhì)的抑菌活性

由圖1可知，地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)6種菌均具有抑制作用，但抑制作用存在差異；隨濃度增加，抑制率增強(qiáng)。在濃度125 mg/mL時(shí)，脂溶性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)到93.78%；其次是金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，黑曲霉，釀酒酵母；抑制率最低的是假單胞菌桿菌，抑制率為58.83%。

圖1 地木耳脂溶性物質(zhì)抑菌作用

2.4 地木耳脂溶性物質(zhì)抑制作用IC50值測(cè)定

從表2可以看出，地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)6種菌都有抑菌作用。地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)假單胞菌桿菌的IC50值最高，為89.58 mg/mL；其次為釀酒酵母、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；對(duì)大腸桿菌IC50值最低，其值為38.75 mg/mL；脂溶性物質(zhì)對(duì)6種菌抑制作用的IC50值之間差異極顯著。從IC50值可以看出，地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)假單胞桿菌抑菌作用最弱。

表2 地木耳脂溶性物質(zhì)的抑菌作用的IC50值分析

2.5 地木耳脂溶性物質(zhì)的最小抑制濃度（MIC）測(cè)定

由表3可知，地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）最小，為64.0 mg/mL；其次為釀酒酵母、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；對(duì)假單胞桿菌的MIC最大，為106.5 mg/mL；不同菌的MIC之間差異極顯著；說明地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng)，對(duì)假單胞桿菌抑制

作用最弱。

表3 地木耳脂溶性物質(zhì)的最低抑制作用（MIC）分析

3 討論

許多植物和藻類中含有一定的抑菌活性物質(zhì)，多糖、黃酮和脂類等具有抑菌有效成分的物質(zhì)也逐漸被確定［12，13］。Mundt等［14］報(bào)道，顫藻中脂肪酸具有一定的抑菌活性。脂肪酸及其衍生物可作用于微生物細(xì)胞膜，引起電子傳遞鏈中斷，氧化磷酸化解偶聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)容物溶出，同時(shí)還可抑制胞內(nèi)酶活性，減小細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也可通過自身氧化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2及活性氧殺死細(xì)菌，以至于其可以有效抑制大腸桿菌及白色念珠菌的生長(zhǎng)繁殖［15］。

本研究通過從地木耳中提取脂溶性物質(zhì)，分析脂溶性物質(zhì)類型，測(cè)定其抑菌活性。結(jié)果可知，地木耳脂溶性物質(zhì)中，石油醚洗脫組分（非極性脂）含量最高，乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）含量其次，苯洗脫組分（弱極性脂）含量最低，這個(gè)研究結(jié)果與嬌柔塔胞藻中3種組分含量相近似。在3種組分中，乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）抑菌作用最強(qiáng)，苯洗脫組分（弱極性脂）抑菌作用次之，石油醚洗脫組分（非極性脂）不具有抑菌作用，該結(jié)論與江紅霞的報(bào)道有差異［9］。這與極性脂中含有極性脂溶性成分——醛類、酯類、有機(jī)酸等有一定的關(guān)系。

4 結(jié)論

地木耳中脂溶性物質(zhì)含量為2.62%，其中，石油醚洗脫組分（非極性脂）含量最高，其次為乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂），苯洗脫組分（弱極性脂）含量最低。乙醇洗脫組分（強(qiáng)極性脂）抑菌作用最強(qiáng)，苯洗脫組分（弱極性脂）抑制作用較弱，石油醚組分（非極性脂）對(duì)菌株抑菌作用不敏感。

地木耳脂溶性物質(zhì)對(duì)6種菌有較好的抑制作用，其抑制能力大小為：大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞黑曲霉＞釀酒酵母＞假單胞桿菌。

［1］ 李敦海, 劉永定.近十年中國(guó)地木耳研究概況［J］.水生生物學(xué)報(bào), 2003, 27（4）：408-412.

［2］ 范群艷, 吳向陽, 仰榴青, 等.地木耳的研究進(jìn)展［J］.常熟理工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2007, 21（4）：55-59.

［3］ 錢森和, 厲榮玉, 魏明, 楊超英.地木耳提取物對(duì)幾種常見微生物的抑菌研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 9（17）：15-17.

［4］ 張?zhí)苽? 楊樂, 柳青海, 等.地木耳多糖的抗氧化性與抑菌作用［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 30（6）：868-873.

［5］ 厲榮玉, 錢森和, 董群, 劉輝.地木耳總黃酮提取及抑菌作用［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 31（3）：186-190.

［6］ 張希, 楊明, 宋飛, 等.脂肪酸及其衍生物的抑菌活性［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2013, 39（2）：155-160.

［7］ 江志利, 張興, 馮俊濤.植物精油研究及其在植物保護(hù)中的利用［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 10（1）：32-36.

［8］ 張國(guó)珍, 樊瑛, 丁萬隆.麻黃和細(xì)辛揮發(fā)油的抗真菌作用［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào), 1995, 22（4）：373-374.

［9］ 江紅霞.嬌柔塔胞藻脂溶性化合物的抑菌活性及成分分析［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 13（17）：34-35.

［10］ Shanab SMM, Shalaby EA. Biological activities and anticorrosion efficiency of water hyacinth（Eichhornia crassipes）［J］. Journal of Medicinal Plants Research, 2012, 6（23）：3950-3962.

［11］ 張雪松, 朱媛.不同提取劑對(duì)花椒油樹脂抑菌活性影響的研究［J］.中國(guó)調(diào)味品, 2010, 35（7）：35-37.

［12］ Padmakumar K, Ayyakkannu K. Seasonal variation of antibacterial and antifungal activities of the extracts of marine algae from southern coasts of India［J］. Botanica Marina, 1997, 40（16）：507-516.

［13］ 王書平, 李玉璽, 張韓杰.抑菌植物資源的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào), 2011, 8（8）：24-28.

［14］ Mundt S, Kreitlow S, Jansen R. Fatty acids with antibacterial activity from the cyanobacterium Oscillatoria redekei HUB051［J］. J Appl Phycol, 2003, 15（23）：263-267.

［15］ Desbois AP, Smith VJ. Antibacterial free fatty acids：activities, mechanisms of action and biotechnological potential［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85（6）：1629-1642.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Study on Antibacterial Effects of Fat-soluble Compositions in Nostoc commune

DiaoYi1，2Yang Zujun1
（1. School of Life Science and Technology，University of Electronic Science and Technology of China，Chengdu 610054；2. College of Biological and Chemical Engineering，Sichuan Province Key Laboratory of Characteristic Biological Resources of Dry and Hot River Valley，Panzhihua University，Panzhihua 617000）

The antibacterial effects of fat-soluble compositions from Nostoc commune Vauch. were studied in order to contribute to diverse nutritional and medicinal values of N. commune. Soxhlet extraction method was used to extract crude fats from N. commune, and antimicrobial activities of the liposoluble compounds and fractions isolated by column chromatography were assayed against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas stutzeri, Asparagillus niger and Saccharomyces cerevisiae. The results showed fat-soluble compositions were about 2.62% in N. commune. Ethanol elution fractions showed most greatly antimicrobial activities against six bacterial stains while its contents was 32% of crube fats, the benzene fraction with the yeild of 14% in crube fats had worse antimicrobial activities than ethanol elution fractions, and the petroleum ether extract was not inhibitory to six bacterial stains with the yeild of 54% in crube fats. Fat-soluble compositions had most strongly inhibitory effect on E.coli with IC5038.75 mg/mL and MIC 64.0 mg/mL and they had least inhibitory effect on Pseudomonas stutzeri with IC5089.58 mg/mL and MIC 106.5 mg/mL. Fat-soluble compositions showed antibacterial effects against six bacterial stains：Escherichia coli ＞Staphylococcus aureus ＞ Bacillus subtilis ＞ Asparagillus niger ＞ Saccharomyces cerevisiae ＞ Pseudomonas stutzeri.

Nostoc commune Vauch. Fat-soluble compositions Antibacterial

2013-10-30

攀枝花市科技局項(xiàng)目（2012CY-S-22（9））

刁毅，男，博士研究生，副教授，研究方向：植物抗病性；E-mail：diaoy163@163.com

楊足君，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué)植物生物技術(shù)育種；E-mail：yangzujun@uestc.edu.cn