響應(yīng)面法優(yōu)化纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基

龔國(guó)利 王娜 劉麗麗
（陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021）

以纖維堆囊菌SOF5-76為試驗(yàn)菌株，用響應(yīng)面分析法對(duì)其產(chǎn)埃博霉素B的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高埃博霉素B的產(chǎn)量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman篩選出對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量有顯著影響的3個(gè)因素為馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉和無(wú)水氯化鈣，在此基礎(chǔ)上通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域；再運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析，確定重要因素的最優(yōu)濃度。得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：馬鈴薯淀粉3.9 g/L、脫脂奶粉2.2 g/L、無(wú)水氯化鈣1.3 g/L、葡萄糖1 g/L，豆餅粉1.5 g/L，七水硫酸鎂2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，VB121 mL/L。在此最優(yōu)條件下發(fā)酵埃博霉素B的產(chǎn)量為29.95 mg/L，與模型預(yù)測(cè)值接近，發(fā)酵產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.1倍。

埃博霉素B 纖維堆囊菌 發(fā)酵培養(yǎng)基 響應(yīng)面法優(yōu)化

埃博霉素（Epothilones）是黏細(xì)菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］，是一種新型的抗腫瘤藥物。其作用機(jī)制與紫杉醇相同，通過(guò)促微管聚合作用從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［2］，并且與紫杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小、水溶性更好［3］、對(duì)紫杉醇耐藥性細(xì)胞作用更強(qiáng)、抗腫瘤譜更廣等優(yōu)點(diǎn)，因此埃博霉素被譽(yù)為最具有潛力的抗腫瘤新藥之一［4-6］。

目前有很多種化學(xué)法可以合成埃博霉素B，但是反應(yīng)條件苛刻，成本高，合成路線長(zhǎng)，產(chǎn)率低，污染環(huán)境，而發(fā)酵法則可以克服上述缺點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)埃博霉素的大規(guī)模生產(chǎn)，生物發(fā)酵是理想的途徑。但是目前該法產(chǎn)量低，不穩(wěn)定，受培養(yǎng)條件和環(huán)境等因素的影響較大，所以在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，主要通過(guò)菌種選育和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件來(lái)提高埃博霉素的產(chǎn)量。

本研究以纖維堆囊菌SOF5-76為試驗(yàn)菌株，該菌株是由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選，經(jīng)基因重組技術(shù)選育獲得的遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株之一，經(jīng)過(guò)為期1年的觀察，此菌株產(chǎn)量較其他菌株（SoF5-09）穩(wěn)定，埃博霉素產(chǎn)量不穩(wěn)定是其研究的一大難題。雖然實(shí)驗(yàn)室前期已采用正交法研究了另一高產(chǎn)菌株SoF5-09的發(fā)酵工藝［7，8］，分別對(duì)埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使埃博霉素產(chǎn)量分別達(dá)到27.5 mg/L、33.5 mg/L。由于菌株的特異性，且試驗(yàn)菌株穩(wěn)定性較好，因此對(duì)其發(fā)酵合成埃博霉素B的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化具有一定的意義。諸景光等［6］曾采用響應(yīng)面法對(duì)埃博霉素發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出的重要因素皆為培養(yǎng)條件相關(guān)的因素，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件系統(tǒng)優(yōu)化的目的。本研究則著重考慮營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)埃博霉素產(chǎn)量的影響，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化。目前，統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)已經(jīng)成功應(yīng)用于一些培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的優(yōu)化［9-13］，本研究采用統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化，旨在提高埃博霉素B產(chǎn)量，且為其規(guī)模化生產(chǎn)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 纖維堆囊菌SoF5-76（Sorangium cellulosumSoF5-76）由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選，經(jīng)過(guò)基因組重組技術(shù)選育獲得，埃博霉素B產(chǎn)量為14.2 mg/L［14］。

1.1.2 培養(yǎng)基 CNST培養(yǎng)基：KNO30.05%，Na2HPO40.025%，MgSO47H2O 0.1%，F(xiàn)eCl30.001%，瓊脂 2%，微量元素液 1 mL/L，pH7.2。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min。

M26培養(yǎng)基：土豆淀粉8.0 g/L，大豆蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖2.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl21.0 g/L，EDTA-Fe3+1 mL/L，微量元素1 mL/L，以KOH調(diào)節(jié)pH值為 7.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精0.3%，蔗糖0.07%，葡萄糖0.02%，豆餅粉0.17%，七水硫酸鎂0.17%，無(wú)水氯化鈣0.3%，EDTA-Fe3+2 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，pH7.2，樹(shù)脂XAD-16 2%。1×105Pa高壓蒸汽滅菌20 min［13］。

1.1.3 試劑 EPothilone B標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Singma公司；XAD-16樹(shù)脂購(gòu)于德國(guó)Sigma公司；馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉、豆餅粉為食品級(jí)，市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，其余試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 Waters-2487-2420-1525高效液相色譜

儀，美國(guó)waters公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)：將保藏在固體斜面培養(yǎng)基的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中在30℃條件下培養(yǎng)5-7 d后，轉(zhuǎn)接于 M26培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，在30℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h后，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：以5%（V/V）接種量將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為300 mL三角瓶裝液量為50 mL，在30℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d。

1.2.2 埃博霉素B提取及含量測(cè)定 埃博霉素B提取：發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾收集樹(shù)脂，用10倍體積甲醇振蕩浸提24 h后，棄去樹(shù)脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500 μL甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到離心管中。

埃博霉素B檢測(cè)：采用HPLC定量分析。液相色譜條件：色譜柱：YWG，C18，10 μm，250×4.6 mm；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：249 nm，流動(dòng)相：甲醇∶水=65∶35（體積比）；上樣體積：20 μL，時(shí)間：30 min，流速：1 mL/min。埃博霉素B的定量采用本實(shí)驗(yàn)室用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。方程為：y=0.132x+0.0035。

采用HPLC檢測(cè)埃博霉素B所得的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成埃博霉素B產(chǎn)量。

1.2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì) Plackett-Burman設(shè)計(jì)用來(lái)確定對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量有顯著影響作用的因子以及去除一些可有可無(wú)的因子。每個(gè)因子設(shè)置高低兩個(gè)水平，分別用“+”、“-“表示，設(shè)定高水平為低水平的2倍。根據(jù)前期單因子試驗(yàn)的結(jié)果，影響埃博霉素B產(chǎn)量的因素有單因子試驗(yàn)初步確定的最佳碳源（馬鈴薯淀粉、葡萄糖）、氮源（豆餅粉、脫脂奶粉、乙酸銨）、生長(zhǎng)因子VB12、無(wú)機(jī)鹽（七水

硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣）鐵離子（EDTA-Fe3+）。 選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，考察上述9個(gè)因素對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量影響的重要性。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn) 由于響應(yīng)面擬合多項(xiàng)式模型只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，所以應(yīng)先使得顯著因素的水平盡量逼近最佳區(qū)域再建立有效的擬合方程，最陡爬坡試驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)篩選出的顯著因素的變化方向、步長(zhǎng)作了相應(yīng)的設(shè)計(jì)。

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn) 逼近最大響應(yīng)區(qū)域后，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)顯著因子進(jìn)行優(yōu)化，尋找菌種發(fā)酵使得EpoB產(chǎn)量達(dá)到最大的最優(yōu)條件。根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，確定顯著因子的高、中、低水平，表征為1、0、-1，使用SAS9.2軟件試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選重要影響因素

自變量編碼和水平因素見(jiàn)表1，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。使用SAS9.2軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析得到了回歸方程以及各影響因子的顯著性（表3）。由表3可知，馬鈴薯淀粉（A）、脫脂奶粉（D）和無(wú)水氯化鈣（G）為影響埃博霉素B產(chǎn)量的顯著因素，除了確定這3個(gè)重要影響因子之外，還據(jù)此對(duì)初始發(fā)酵培養(yǎng)基做出相應(yīng)的改變和調(diào)整，氮源中由于乙酸銨對(duì)埃博霉素B 產(chǎn)量的影響甚小，故在后續(xù)試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基去掉這一成分，其余不顯著的變量的取值結(jié)合效應(yīng)的正負(fù)和節(jié)約正本的原則，進(jìn)行調(diào)整。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平及編碼

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及響應(yīng)值

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)中各因素的效應(yīng)分析

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)分析的結(jié)果，結(jié)合試驗(yàn)的實(shí)際需要，在最陡爬坡試驗(yàn)中對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量影響顯著的因素的變化方向、步長(zhǎng)作了相應(yīng)的設(shè)計(jì)，具體取值和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，埃博霉素B產(chǎn)量的變化趨勢(shì)是先上升后下降，其中從中心點(diǎn)開(kāi)始到3Δ之間都顯著增加，在0+3Δ水平上達(dá)到最大值，3Δ以后埃博霉素B產(chǎn)量開(kāi)始下降，

由此判斷出最佳發(fā)酵條件在0+3Δ水平附近，故以0+3Δ水平為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析 以馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉和氯化鈣3個(gè)重要因素為自變量，以埃博霉素B產(chǎn)量為響應(yīng)值。各因素編碼水平見(jiàn)表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表6中試驗(yàn)結(jié)果，利用SAS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，獲得的回歸方程為：

Y=29.78+1.88125X1-1.085X2+0.21125X3-1.6 0 6 2 5 X1X1-1.3 0 5 X1X2-0.8 6 7 5 X1X3-1.63375X2X2+0.59X2X3-0.79625X3X3

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7，模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表8。

從表7中可以看出模型在α=0.01水平上回歸顯著（Pr＞F小于0.01）；失擬項(xiàng)（P=0.0889＞0.05），失擬項(xiàng)不顯著，因此模型選擇正確，復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9541，說(shuō)明模型可以解釋95.41%試驗(yàn)所得埃博霉素B產(chǎn)量的變化，表明方程擬合較好，試驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測(cè)值之間具有較好的一致性。Y的變異系數(shù)CV表示試驗(yàn)的精確度，CV值越高，試驗(yàn)的可靠性越低，本試驗(yàn)中CV值相對(duì)較低，說(shuō)明了試驗(yàn)操作可靠。

表7 回歸方程的方差分析

表8 回歸系數(shù)的t值檢驗(yàn)

回歸方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，模型一次項(xiàng)X1極顯著，X2顯著；二次項(xiàng)X1X1、X1X2、X2X2對(duì)響應(yīng)值有顯著的影響，且X1（土豆淀粉）X2（脫脂奶粉）有交互作用，交互作用顯著，說(shuō)明土豆淀粉、脫脂奶粉是該發(fā)酵過(guò)程的重要影響因素。

2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)基成分確定 利用SAS軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面分析圖及其等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖1-3，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，每個(gè)響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第3個(gè)變量保持在中心點(diǎn)水平不變。從其等高線圖可以直觀看出兩因素的交互作用，等高線的形狀反映出交互作用效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，等高線形狀越接近橢圓形表示交互作用越強(qiáng)。

回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即存在極值點(diǎn)（X1，X2，X3）使得響應(yīng)變量Y取得最大值。通過(guò)嶺脊分析（ridge analysis）得到極大值所對(duì)應(yīng)的各主要因素（X1，X2，

X3）的編碼值分別為（0.747817，-0.57091，-0.33886），即馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉、無(wú)水氯化鈣的最佳濃度為3.8739 g/L、2.2145 g/L、1.3306 g/L，此時(shí)埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到最高為31.1036 mg/L。

圖1 Y= f（X1，X2）響應(yīng)面立體分析圖

圖2 Y= f（X1，X3）響應(yīng)面立體分析圖

圖3 Y= f（X2，X3）響應(yīng)面立體分析圖

2.4 模型的驗(yàn)證

在以上確定的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)將優(yōu)化前培養(yǎng)基作為對(duì)照。優(yōu)化培養(yǎng)基埃博霉素B的平均產(chǎn)量為29.95 mg/L，預(yù)測(cè)結(jié)果31.1036與驗(yàn)證試驗(yàn)平均值十分接近，說(shuō)明了試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合性，模型的有效性，同時(shí)與初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)生的埃博霉素B（14.2 mg/L）相比產(chǎn)量提高了1.1倍。

3 討論

目前已有一些關(guān)于埃博霉素發(fā)酵合成的報(bào)道。韓莉莉等［3］采用單因子法研究培養(yǎng)基組成對(duì)埃博霉素產(chǎn)量的影響，使埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到7 mg/L左右，比原始條件提高了2.88倍；本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化纖維堆囊菌SoF5-09產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵培養(yǎng)基，埃博霉素B產(chǎn)量為27.5 mg/L，提高了74%［7］；諸景光等［6］采用響應(yīng)面法優(yōu)化埃博霉素的發(fā)酵條件，埃博霉素產(chǎn)量為14.12 mg/L，提高了18%。曹文瑞等［15］通過(guò)多步驟響應(yīng)面法優(yōu)化So0157-2合成埃博霉素營(yíng)養(yǎng)條件，使埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到82 mg/L，比優(yōu)化前提高了7.2倍，充分表明了響應(yīng)面法優(yōu)化纖維堆囊菌野生菌合成埃博霉素營(yíng)養(yǎng)條件的有效可行性。國(guó)外則更多的關(guān)注埃博霉素合成基因的易源表達(dá)及其臨床研究，關(guān)于發(fā)酵工藝方面報(bào)道較少。Lau等［16］采用半連續(xù)發(fā)酵法以及添加吸附樹(shù)脂等方法試圖提高異源菌株合成埃博霉素產(chǎn)量；Regentin等［4］對(duì)比了本源菌和異源宿主發(fā)酵合成埃博霉素過(guò)程中對(duì)銨離子、磷酸鹽以及鐵離子的耐受程度。然而埃博霉素產(chǎn)量的不穩(wěn)定性及產(chǎn)量有待進(jìn)一步提高的問(wèn)題仍是目前備受關(guān)注的焦點(diǎn)。由于纖維堆囊菌易受外界環(huán)境條件的影響，且表現(xiàn)出明顯的菌株特異性，為了提高纖維堆囊菌SoF5-76發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B的水平以降低生產(chǎn)成本，本研究從營(yíng)養(yǎng)條件著手，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)從可能影響埃博霉素B產(chǎn)量的9個(gè)因素中篩選出3個(gè)顯著因素，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)其水平進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到纖維堆囊菌SoF5-76的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。在此最優(yōu)條件下，埃博霉素B產(chǎn)量（29.95mg/L）比優(yōu)化前（14.2 mg/L）提高了1.1倍。橫向比較，本試驗(yàn)優(yōu)化水平還有提高的空間，且本試驗(yàn)菌株的產(chǎn)量較穩(wěn)定。得到的優(yōu)化培養(yǎng)基相比初始培養(yǎng)基增加了VB12和脫脂奶粉兩個(gè)成分。VB12作為生長(zhǎng)因子有利于菌體的生長(zhǎng)，上述試驗(yàn)表明脫脂奶粉是影響埃博霉素B產(chǎn)量的重要因素，這可能是

因?yàn)槊撝谭酆幸恍┯欣诰w生長(zhǎng)或埃博霉素B產(chǎn)生的氨基酸類，氨基酸可以提供大環(huán)內(nèi)酯類抗生素生物合成過(guò)程中所需要的前體物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［17］，前體氨基酸能促進(jìn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素合成，但是沒(méi)有有關(guān)埃博霉素的報(bào)道，后續(xù)工作將基于埃博霉素B的生物合成途徑對(duì)埃博霉素B的發(fā)酵工藝進(jìn)一步優(yōu)化，預(yù)期將獲得更高的發(fā)酵水平。

4 結(jié)論

對(duì)埃博霉素產(chǎn)量有顯著影響的3個(gè)因素為馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉和無(wú)水氯化鈣；在此最優(yōu)條件下，埃博霉素B產(chǎn)量可達(dá)到29.95 mg/L，發(fā)酵產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了1.1倍。用響應(yīng)面法優(yōu)化纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵培養(yǎng)基是有效可行的。

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Medium Optimization for Enhanced Production of Epothilone B by Sorangium cellulosum SoF5-76 Using Response Surface Methodology

Gong Guoli Wang Na Liu Lili
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021）

The response surface methodology（RSM）was employed to optimize the medium composition for Epothilone B produced by Sorangium cellulosum SoF5-76. On the basis of one-variable-at-a-time design, using Plackett-Burman design, potato starch, skimmed milk powder and calcium chloride were screened out of 9 factors as main affecting variables of Epothilone B production, and then steepest ascent method was used to approach their maximum response regions, followed by Box-Behnken design, multiple regression analysis and response surface analysis. The optimum medium formula determined was composed of potato starch 3.9 g/L, skim milk powder 2.2 g /L, chlorine calcium 1.3 g/L, glucose 1 g/L, soybean powder 1.5 g/L, magnesium sulfate 2.5 g/L, EDTA-Fe3+3 mL/L, trace elements 0.5 mL/L, VB121 mL/L. Under this optimal conditions, Epothilone B production reached up to 29.95 mg/L and increased 1.1 times in average as compared with preliminary culture and consistent with the maxmum predicted value.

Epothilone B Sorangium cellulosum Fermentation medium Response surface methodology optimization

2013-08-15

陜西省教育廳自然科學(xué)專項(xiàng)（12JK1023），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20906058）

龔國(guó)利，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物制藥技術(shù)；E-mail：gongguoli@sust.edu.cn