徐麗香 王作鎮(zhèn) 舒正玉 武海龍 劉艷如 李欣 黃建忠

（1. 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350108；2. 福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物工程中心，福州 350108；3. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108）

細(xì)菌脂肪酶在大腸桿菌細(xì)胞表面的功能性展示

徐麗香 王作鎮(zhèn) 舒正玉 武海龍 劉艷如 李欣 黃建忠

（1. 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350108；2. 福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物工程中心，福州 350108；3. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108）

細(xì)胞表面展示技術(shù)已廣泛應(yīng)用于突變文庫的高通量篩選，有力地促進(jìn)了蛋白質(zhì)工程的發(fā)展。以來自于銅綠假單胞菌的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Est A的羧基端結(jié)構(gòu)域作為錨定區(qū)，構(gòu)建脂肪酶LipA與EstA羧基端結(jié)構(gòu)域的融合基因，并將融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表達(dá)載體中，獲得表面展示載體pBCCB-X1。將載體pBCCB-X1分別導(dǎo)入到大腸桿菌JK321和大腸桿菌UT5600菌株中，以IPTG誘導(dǎo)融合基因的表達(dá)。分別用三丁酸甘油酯定性檢測和pNPO定量檢測誘導(dǎo)表達(dá)后的全細(xì)胞脂肪酶的水解活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，脂肪酶LipA在大腸桿菌JK321和大腸桿菌UT5600細(xì)胞表面均得到功能性展示，水解活性分別為（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。脂肪酶LipA在大腸桿菌細(xì)胞表面的功能性展示，為后續(xù)高通量篩選LipA突變基因文庫，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

大腸桿菌 細(xì)胞表面展示 脂肪酶A 枯草芽胞桿菌

脂肪酶，又稱三酰甘油酯水解酶（Triacylglycerol lipase，EC3.1.1.3），能有效地催化各種底物的酯解反應(yīng)。作為一種非水相酶，脂肪酶在各種有機(jī)體系（無水體系或微水體系）中，還能高效催化醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)及轉(zhuǎn)酯反應(yīng)等多種反應(yīng)。作為一種重要的工業(yè)生物催化劑，脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、去污劑、油脂深加工、手性藥物合成等領(lǐng)域［1，2］。

在已知的各種脂肪酶資源中，來自于枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）的脂肪酶LipA具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和催化活性，已引起學(xué)界和業(yè)界的廣泛關(guān)注。該脂肪酶的3D結(jié)構(gòu)不具有大多數(shù)微生物脂肪酶結(jié)構(gòu)所具有的蓋子結(jié)構(gòu)域（Lid domain），因此并

不表現(xiàn)出大多數(shù)脂肪酶所具有的界面激活（Interfacial activation）的催化特性［3］；在其3D結(jié)構(gòu)中，也沒有二硫鍵，因此耐受各類氧化劑的能力較其他脂肪酶更高。近年來，盡管利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA已獲得巨大的成功［4］，但依然存在許多技術(shù)性障礙。例如，如何建立枯草芽胞桿菌的高效轉(zhuǎn)化體系［5，6］，如何對突變基因文庫實(shí)現(xiàn)高通量篩選等問題，制約了對該脂肪酶的進(jìn)一步深入分子改造。

細(xì)胞表面展示技術(shù)（Cell surface display）是利用運(yùn)載蛋白，將靶蛋白展示在宿主細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)技術(shù)?；诩?xì)胞表面展示技術(shù)發(fā)展出的熒光激活細(xì)胞分選法（Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）等超高通量篩選技術(shù)，已成功應(yīng)用于對酶分子定向突變進(jìn)化文庫的篩選工作，并取得良好的效果［7，8］。在已發(fā)展出的各種細(xì)胞表面展示系統(tǒng)中，大腸桿菌（Escherichia coli）細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，因其遺傳背景清晰，遺傳操作簡單，因此成為各種靶蛋白展示的首選展示系統(tǒng)。到目前為止，來自于熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）脂肪酶、芽胞桿菌屬（Bacillussp.）脂肪酶、南極假絲酵母（Candida antarctica）脂肪酶B等已在大腸桿菌細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)功能性展示［9-11］。如何實(shí)現(xiàn)具有較大分子量的酶分子的高效功能性展示及共展示不同酶分子，獲得具有多種催化活性的全細(xì)胞催化劑，從而將多步催化反應(yīng)偶聯(lián)起來，是大腸桿菌細(xì)胞表面展示系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)［12-14］。本研究以來自于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Est A作為運(yùn)載蛋白，成功地將枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA展示到大腸桿菌細(xì)胞的表面，為后續(xù)利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造在脂肪酶LipA奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)中使用及構(gòu)建的質(zhì)粒及菌株見表1。質(zhì)粒pMD18-T simple、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA marker及LA Taq DNA聚合酶等購自大連TaKaRa寶生物公司；SanPrep質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；各類抗生素購自鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司（福州），其使用濃度分別為：氨芐青霉素，40 μg/mL；氯霉素，50 μg/mL；三丁酸甘油酯購自國藥公司；對硝基苯酚辛酸酯（4-Nitrophenyl octanoate，pNPO）購自 Sigma 公司；其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

表1 本試驗(yàn)使用的菌株及質(zhì)粒

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞表面展示質(zhì)粒pBCMB-X1的構(gòu)建 用于大腸桿菌細(xì)胞表面功能性展示枯草芽胞桿菌胞外脂肪酶LipA的重組質(zhì)粒pBCMB-X1的構(gòu)建流程，如圖1。構(gòu)建該重組質(zhì)粒使用的引物、引物的Tm值及其攜帶的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，見表2。試驗(yàn)過程中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的引物、模板、PCR擴(kuò)增條件及其擴(kuò)增產(chǎn)物大小，見表3。具體構(gòu)建過程如下：以質(zhì)粒pUC19為模板，以lacZ PF和lacZ PR為引物對，PCR擴(kuò)增lacZ的啟動(dòng)子。PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物大小，見表3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pACYCDuet分

別用限制性內(nèi)切酶EcoNⅠ和NcoⅠ酶切。酶切產(chǎn)物純化后，用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α；以氯霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，抽提并酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pBCMB-W1。驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序，進(jìn)一步驗(yàn)證該質(zhì)粒的正確性。

圖1 細(xì)胞表面展示質(zhì)粒pBCMB-X1構(gòu)建流程圖

表2 本試驗(yàn)中使用的PCR引物

表3 本試驗(yàn)PCR擴(kuò)增條件及其產(chǎn)物

以枯草芽胞桿菌的基因組為模板，以lipA CF和lipA CR為引物對，PCR擴(kuò)增lipA基因。PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物大小，見表3。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，克隆到pMD18-T Simple中，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α。以氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，抽提并PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒pMD18-T-lipA。驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

本課題組先前已克隆完整的銅綠假單胞菌自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EstA編碼基因（NCBI核酸數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)為JN601114）。以銅綠假單胞菌AFU01菌株基因組DNA為模板，以estA EF / estA ER為引物對，PCR擴(kuò)增estA'基因片段。PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物大小，見表3。

先以枯草芽胞桿菌的基因組為模板，以lipA EF和lipA ER為引物對，PCR擴(kuò)增lipA基因。PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物大小，見表3。純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物lipA與estA'片段按照一定的比例混合，并以此混合物為模板，以lipA EF / estA ER為引物對，PCR擴(kuò)增lipA-estA'融合基因片段。PCR擴(kuò)增條件及擴(kuò)增產(chǎn)物大小，見表3。

分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind III對lipA-estA'融合基因片段及質(zhì)粒pBCMB-W1進(jìn)行酶切。純化后的酶切產(chǎn)物再按一定的比例混合，用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5α。以氯霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，抽提并酶切驗(yàn)證、PCR驗(yàn)證重組質(zhì)粒pBCMB-X1。驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒pBCMB-X1進(jìn)一步送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗(yàn)證。

1.2.2 脂肪酶lipA的誘導(dǎo)表達(dá) 將測序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pBCMB-X1和pBCMB-W1分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E. coliJK321和E.coliUT5600菌株中，氯霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子。37℃過夜培養(yǎng)，從平板上分別挑取單菌落接種于含有50 μg/mL的氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物菌體密度OD600達(dá)到0.6時(shí)，向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L。30℃ 200 r/min誘導(dǎo)lipA基因表達(dá)。12 h后4 000 r/min離心培養(yǎng)物，去掉上清，收集菌體。菌體再用20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH7.4）洗滌2次，并重懸在相同的緩沖溶液中，4℃保存。1.2.3 細(xì)胞表面展示脂肪酶酶活的定性與定量測定 細(xì)胞表面展示脂肪酶酶活的平板定性檢測方法參照Hiol 等［16］的平板檢測方法并略作修改。用于定性檢測的LB固體培養(yǎng)基中同時(shí)添加有1 mmol/L IPTG，50 μg/mL 氯霉素和3%（V/W）的三丁酸甘油酯乳化液。分別將4種轉(zhuǎn)化子E. coliJK321-pBCMBX1、E. coliJK321-pBCMB-W1、E. coliUT5600-pBCMB-W1、E. coliUT5600-pBCMB-X1的單菌落點(diǎn)接到定性檢測平板上，37℃培養(yǎng)2 d后觀察水解圈的產(chǎn)生情況。

細(xì)胞表面展示脂肪酶酶活的定量測定采用比色法，參照Kordel 等［17］的檢測方法，并略作修改。首先分別測定材料與方法1.2.2部分收集的菌懸液的OD600值。然后取150 μL菌懸液加入到2 820 μL 20 mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液中，同時(shí)向反應(yīng)體系中加入30 μL 2.5 mmol/L的對硝基苯辛酸酯。37℃反應(yīng)5 min后，離心收集上清液，測定其OD410值。酶活單位定義為：在該反應(yīng)條件下，每分鐘釋放出1 μmol 對硝基苯酚所需要的酶量（OD600）作為1個(gè)酶活單位（U/OD600）。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽胞桿菌脂肪酶基因的克隆與序列分析

從枯草芽胞桿菌YU01菌株克隆出的脂肪酶lipA基因，已提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為JX048066。該基因全長為639 bp，編碼212個(gè)氨基酸殘基。與其他已得到功能驗(yàn)證或結(jié)構(gòu)解析的枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA（如圖2中1I6W，2QXT和1T4M等）具有高度的同源性。比對結(jié)果（圖2）表明，Ser108、Asp164和His187構(gòu)成了LipA的催化三聯(lián)體，并且Ser108位于保守五肽（Ala-His-Ser-Met-Gly）中。

2.2 枯草芽胞桿菌脂肪酶表面展示載體的構(gòu)建

構(gòu)建完成后的細(xì)胞表面展示載體pBCMB-X1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，如圖3-A。較初始質(zhì)粒pACYCDuet而言，pBCMB-X1質(zhì)粒的啟動(dòng)子變更為lacZ啟動(dòng)子，同時(shí)在其多克隆位點(diǎn)MCS1處插入了lipA與estA'的融合基因。啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)、靶蛋白、運(yùn)載蛋白編碼區(qū)測序結(jié)果， 如圖3-B。 測序結(jié)果表明， 編碼區(qū)序列正確。

2.3 細(xì)胞表面展示脂肪酶酶活的測定

細(xì)胞表面展示脂肪酶定性檢測結(jié)果，如圖4-A。攜帶有融合基因的E. coliUT5600-pBCMB-X1（菌

落3）和E. coliJK321-pBCMB-X1（菌落4）較對照菌株E. coliUT5600-pBCMB-W1（菌落1）和E. coliJK-321-pBCMB-W1（菌落2）而言，菌落周圍有明顯的水解圈，表明該菌株能產(chǎn)生具有活性的脂肪酶。進(jìn)一步利用對硝基苯酚辛酸酯作為底物進(jìn)行定性測定結(jié)果表明，E. coliJK321-pBCMB-X1和E. coliUT5600-pBCMB-X1的酶活分別為（2.8±0.1）U/OD和（2.6±0.06）U/OD。

圖2 枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA的氨基酸序列與其他LipA的氨基酸序列比對

圖3 細(xì)胞表面展示載體pBCMB-X1結(jié)構(gòu)示意圖（A）及其序列分析圖（B）

圖4 細(xì)胞表面展示脂肪酶酶活的定性分析（A）及定量測定（B）

3 討論

本研究通過改造低拷貝數(shù)質(zhì)粒pACYCDuet成功實(shí)現(xiàn)枯草芽胞桿菌脂肪酶LipA在大腸桿菌細(xì)胞表面的功能性展示。在前期試驗(yàn)中，我們曾嘗試?yán)胮HSG398功能性展示LipA，但試驗(yàn)未能成功，推測pHSG398為pMB1復(fù)制子，該質(zhì)粒為高拷貝數(shù)質(zhì)粒，而外源靶蛋白的大量表達(dá)對受體菌的生長可能具有一定的消極影響，從而導(dǎo)致表面展示試驗(yàn)的失敗［18］。在后續(xù)試驗(yàn)中，我們選用低拷貝數(shù)的pACYCDuet質(zhì)粒（復(fù)制子為P15A）作為原始出發(fā)質(zhì)粒，構(gòu)建細(xì)胞表面展示載體。然而，pACYCDuet質(zhì)粒使用T7啟動(dòng)子，為強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，因此在展示靶蛋白LipA之前，先將pACYCDuet質(zhì)粒第一個(gè)多克隆位點(diǎn)的啟動(dòng)子置換為lacZ啟動(dòng)子。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過降低質(zhì)?？截悢?shù)，啟用弱啟動(dòng)子等途徑降低靶蛋白的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)靶蛋白功能性展示的工作是必要的。

運(yùn)載蛋白也是影響靶蛋白功能性展示的一個(gè)重要因子。本研究選用來自于銅綠假單胞菌的EstA蛋白的羧基端結(jié)構(gòu)域作為錨定靶蛋白的運(yùn)載蛋白。EstA是定位于細(xì)胞外膜并有部分結(jié)構(gòu)域伸展到胞外的自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Autotransporter），其羧基末端具有12個(gè)β-折疊形成的β-桶狀結(jié)構(gòu)，插入到細(xì)胞膜的外膜，形成一個(gè)分泌通道［19，20］?；贓stA蛋白的羧基端結(jié)構(gòu)域作為錨定蛋白構(gòu)建的細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，已有諸多成功報(bào)道［14，21，22］。本試驗(yàn)正是基于這些成功實(shí)驗(yàn)結(jié)果，直接選用羧基端的β1-β8作為錨定區(qū)，實(shí)現(xiàn)了LipA的高效功能性表面展示［21］。

受體菌是影響靶蛋白功能性展示的另一個(gè)重要因子。本研究比較了E. coliUT5600和E. coliJK321對靶蛋白實(shí)現(xiàn)功能性表面展示的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，上述兩個(gè)受體菌展示的LipA的水解活性，未見顯著性差異。受體菌E. coliUT5600和E. coliJK321兩者之間的唯一差異在于：在E. coliJK321菌株中，影響蛋白質(zhì)二硫鍵形成的dsbA基因因插入失活［15］。而本試驗(yàn)被展示的靶蛋白LipA三級(jí)結(jié)構(gòu)中，不存在二硫鍵，推測這是兩個(gè)受體菌水解活性沒有顯著性差異的主要原因。

本研究首次報(bào)道利用改造后的共展示載體pACYCDuet，在其第一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS1），插入脂肪酶編碼基因與自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EstA羧基端編碼區(qū)的融合基因，成功實(shí)現(xiàn)脂肪酶A在大腸桿菌細(xì)胞表面的功能性展示。為后續(xù)在載體的第2個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS2）插入其他酶基因（如Amidase，氨解酶）并實(shí)現(xiàn)脂肪酶與氨解酶共展示，從而將酯解和氨解兩個(gè)過程偶聯(lián)起來，提高手性銨對映體的拆分。

4 結(jié)論

本研究以E. coliJK321和E. coliUT5600作為受體菌株，以自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Est A的羧基端結(jié)構(gòu)域作為錨定區(qū)，利用脂肪酶LipA自身的信號(hào)肽介導(dǎo)融合蛋白（脂肪酶與Est A羧基端融合）的分泌，成功地將枯草芽胞桿菌的脂肪酶LipA功能性地展示到受體菌株的表面。展示有脂肪酶LipA的全細(xì)胞E. coliJK321和E. coliUT5600對底物對硝基苯酚辛酸酯的水解活性分別為（2.8±0.1）U/OD和 （2.6±0.06）U/OD。

致謝：

感謝西班牙國家生物技術(shù)中心的de Lorenzo Víc-

tor 教授及Fernández Luis Angel博士慷慨饋贈(zèng)本試驗(yàn)使用的E. coliUT5600和E. coliJK321菌株。

［1］ Jaeger KE, DljkstraI BW, Reetz MT. Bacterial biocatalysts：molecular biology, three-dimensional structures and biotechnological applications of lipases［J］. Annu Rev Microbiol, 1999, 53：315-351.

［2］ Hasan F, Shah AA, Hameed A. Industrial applications of microbial lipases［J］. Enzyme Microb Technol, 2006, 39（2）：235-251.

［3］ van Pouderoyen G, Eggert T, Jaeger KE, et al. The crystal structure ofBacillus subtilislipase：a minimal α/β hydrolase fold enzyme［J］. J Mol Biol, 2001, 309（1）：215-226.

［4］ Reetz MT, Carballeira JD. Iterative saturation mutagenesis（ISM）for rapid directed evolution of functional enzymes［J］. Nat Protoc, 2007, 2（4）：891-903.

［5］ Zhang XZ, Zhang Y. Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase inBacillus subtilis［J］. Microb Biotechnol, 2011, 4（1）：98-105.

［6］ Vojcic L, Despotovic D, Martinez R, et al. An efficient transformation method forBacillus subtilisDB104［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94（2）：487-493.

［7］ Becker S, Schmoldt HU, Adams TM, et al. Ultra-high-throughput screening based on cell-surface display and fluorescence-activated cell sorting for the identification of novel biocatalysts［J］. Curr Opin Biotechnol, 2004, 15（4）：323-329.

［8］ Yang G, Withers SG. Ultrahigh-throughput FACS-based screening for directed enzyme evolution［J］. Chembiochem, 2009, 10（17）：2704-2715.

［9］ Baek JH, Han MJ, Lee SH, et al. Enhanced display of lipase on theEscherichia colicell surface, based on transcriptome analysis［J］. Appl Environ Microbiol, 2010, 76（3）：971-973.

［10］ Lee SH, Choi JI, Park SJ, et al. Display of bacterial lipase on theEscherichia colicell surface by using FadL as an anchoring motif and use of the enzyme in enantioselective biocatalysis［J］. Appl Environ Microbiol, 2004, 70（9）：5074-5080.

［11］ Narita J, Okano K, Tateno T, et al. Display of active enzymes on the cell surface ofEscherichia coliusing PgsA anchor protein and their application to bioconversion［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 70（5）：564-572.

［12］ Kranen E, Detzel C, Weber T, et al. Autodisplay for the coexpression of lipase and foldase on the surface of E. coli：washing with designer bugs［J］. Microb Cell Fact, 2014, 13：19.

［13］ Rutherford N, Mourez M. Surface display of proteins by Gramnegative bacterial autotransporters［J］. Microb Cell Fact, 2006, 5：22.

［14］ Yang TH, Kwon MA, Song JK, et al. Functional display ofPseudomonasandBurkholderialipases using a translocator domain of EstA autotransporter on the cell surface ofEscherichia coli［J］. J Biotechno, 2010, 146（3）：126-129.

［15］ Veiga E, de Lorenzo V, Fernández LA. Probing secretion and translocation of a beta-autotransporter using a reporter single-chain Fv as a cognate passenger domain［J］. Mol Microbiol, 1999, 33（6）：1232-1243.

［16］ Hiol A, Jonzo MD, Rugani N, et al. Purification and characterization of an extracellular lipase from a thermophilicRhizopus oryzaestrain isolated from palm fruit［J］. Enzyme Microb Technol, 2000, 26（5-6）：421-430.

［17］ Kordel M, Hofmann B, Schomburg D, et al. Extracellular lipase ofPseudomonassp. strain ATCC 21808：purification, characterization, crystallization, and preliminary X-ray diffraction data［J］. J Bacteriol, 1991, 173（15）：4836-4841.

［18］ Becker S, Theile S, Heppeler N, et al. A generic system for theEscherichia colicell-surface display of lipolytic enzymes［J］. FEBS Lett, 2005, 579（5）：1177-1182.

［19］ Wilhelm S, Tommassen J, Jaeger KE. A novel lipolytic enzyme located in the outer membrane ofPseudomonas aeruginosa［J］. J Bacteriol, 1999, 181（22）：6977-6986.

［20］ van den Berg B. Crystal structure of a full-length autotransporter［J］. J Mol Biol, 2010, 396（3）：627-633.

［21］ Yang TH, Pan JG, Seo YS, et al. Use ofPseudomonas putidaEstA as an anchoring motif for display of a periplasmic enzyme on the surface ofEscherichia coli［J］. Appl Environ Microbio, 2004, 70（12）：6968-6976.

［22］ Nicolay T, Lemoine L, Lievens E, et al. Probing the applicability of autotransporter based surface display with the EstA autotransporter ofPseudomonas stutzeriA15［J］. Microb Cell Fact, 2012, 11：158.

（責(zé)任編輯 李楠）

Display of Functionally Active Lipases on the Escherichia coli Cell Surface

Xu Lixiang Wang Zuozhen Shu Zhengyu Wu Hailong Liu Yanru Li Xin Huang Jianzhong
（1. National & Local United Engineering Research Center of Industrial Microbiology and Fermentation Technology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108；2. Engineering Research Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108；3. College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108）

Cell-surface display technology was used widely in the filed of high throughput screening of a mutant library, which promoted the development of protein engineering. The carboxyl terminal domain of the EstA from Pseudomonas aeruginosa was used as carrier protein and the lipA gene was fused to the estA’ gene by overlap extension PCR. The fusion gene lipA-estA’ was then inserted the genetically modified plasmid pACYC-Duet, which promoter was changed into lacZ promoter. The resulting plasmid pBCMB-X1 was transformed into E. coli JK321 and E. coli UT5600, respectively. The lipA gene was induced expression by IPTG and the recombinant LipA was functionally displayed on the cell surface of E. coli JK321 and E. coli.UT5600, respectively. The hydrolysis activity of the LipA was（2.8±0.1）U/OD and（2.6±0.06）U/ OD, respectively.

Escherichia coli Cell surface display Lipase A Bacillus subtilis

2014-02-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370802），福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2013H0021），福建省自然科學(xué)基金杰青項(xiàng)目（2009J06013）

徐麗香，女，研究方向：酶工程；E-mail：897787452@qq.com；王作鎮(zhèn)同為本文第一作者

舒正玉，男，博士，副教授，研究方向：酶工程；E-mail：shuzhengyu@gmail.com黃建忠，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)生物技術(shù)；E-mail：hjz@fjnu.edu.cn