姜正軍劉樹海王茂超程全明黃金，2

（1.山東華辰生物科技有限公司，濰坊 261061；2.浙江工業(yè)大學藥學院，杭州 310014）

畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的工藝研究

姜正軍1劉樹海1王茂超1程全明1黃金1，2

（1.山東華辰生物科技有限公司，濰坊 261061；2.浙江工業(yè)大學藥學院，杭州 310014）

考察了10 L罐規(guī)模條件下pH、溫度、裝液量以及碳源流加模式對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響，確定了最優(yōu)的生產(chǎn)工藝：在pH5.5、28℃、40%裝液量條件下，當初始碳源耗盡的情況下，進行甘油和甲醇混合（流加體積速率比為20∶1）脈沖流加，產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性最高，可達3×106IU/mL。將該工藝在50 L發(fā)酵罐規(guī)模條件下進行放大，重復20批，結(jié)果表明此過程重復性較好，且目的蛋白表達量穩(wěn)定，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實際應(yīng)用價值。

畢赤酵母 雞α-干擾素 優(yōu)化 放大

近年來，雞的烈性病毒性傳染病在我國部分地區(qū)及世界范圍呈流行趨勢，如禽流感、法氏囊病、新城疫、馬立克氏病等，已成為公共衛(wèi)生的一大危害。僅2013年國內(nèi)報道了135例人感染禽流感病例，造成45例發(fā)病死亡，長三角地區(qū)因H7N9禽流感疫情撲殺銷毀的禽類據(jù)不完全統(tǒng)計達到數(shù)百萬只。同時，據(jù)報道目前種種跡象和最新的科學試驗結(jié)果都表明今年秋冬季節(jié)天氣轉(zhuǎn)冷時H7N9禽流感很可能還將在我國卷土重來［1］。屆時，無疑對畜禽業(yè)的發(fā)展又將是一場劫難。

隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，加之天然干擾素在生產(chǎn)和應(yīng)用中的限制，使得利用基因工程手段介入干擾素的生產(chǎn)成為了生產(chǎn)和研發(fā)的主流。20世紀70年代起，研究者就開始探索利用基因工程手段進行IFN的生產(chǎn)，取得了很大進步。近年來，國內(nèi)對雞干擾素的研究陸續(xù)展開，但多數(shù)側(cè)重于雞II型干擾素（IFN-γ）的研究和開發(fā)，而對雞I型干擾素（IFN-α）的研究和開發(fā)主要集中在基因克隆及其表達上［2，3］。因中下游發(fā)酵技術(shù)以及高密度培養(yǎng)理論未能有效銜接上游分子改造，致使利用重組工程菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)干擾素過程中遇到高密度培養(yǎng)困難、工藝控制復雜、生產(chǎn)穩(wěn)定性差、生產(chǎn)規(guī)模放大困難等問題，已成為制約我國干擾素生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸問題。

本課題組前期研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功地進行了雞I型干擾素（IFN-α）的表達，將去掉全閱讀框的信號肽序列后的雞干擾素成熟蛋白的基因序列整合到酵母表達載體pPICZa-A上。重組菌獲得外源蛋白（雞IFN-α）純度大于70%，經(jīng)過65 636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100-1 000 TCID50的水皰性口炎病毒的攻擊。同時其對VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段抑制能力尤為明顯［4，5］。本研究在前期試驗的基礎(chǔ)上，進行畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的工藝優(yōu)化和放大試驗，獲得較為成熟的工藝，旨在為雞α-干擾素規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 雞α-干擾素重組酵母菌Pichia pastorisIFNα-pPICZαA，由南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，18.218% D-山梨醇。115℃，20 min滅菌。

種子培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%胰蛋白胨，1%甘油，1.34% YNB和4×10-7生物素（滅菌后過濾添加），用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)初始pH6.0，121℃，20 min滅菌。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%胰蛋白胨，0.5%甲醇、1.34% YNB和4×10-7生物素（滅菌后過濾添加），用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)初始pH6.0，121℃，20 min滅菌。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將從平板單菌落挑2環(huán)接入活化培養(yǎng)基（100 mL/500 mL搖瓶）中，在30℃，220 r/min下培養(yǎng)24 h后，以10 %（V/V）接種量接入裝有2.5 L種子培養(yǎng)基的5 L種子罐中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，pH6.0，轉(zhuǎn)速300 r/min，通風量為1.0 vvm，培養(yǎng)至OD650= 40以上時，以10%（V/V）接種量壓入10 L發(fā)酵罐中，初始轉(zhuǎn)速為300 r/min，初始裝液量60%，溫度30℃，pH6.0；對于50 L規(guī)模發(fā)酵放大試驗，以10 L罐為二級種子罐（其培養(yǎng)條件同5 L種子罐），初始發(fā)酵條件與10 L規(guī)模試驗相同，過程調(diào)控轉(zhuǎn)速和通氣量保持溶解氧濃度大于10%；發(fā)酵過程脈沖流加甲醇、甘油或葡萄糖，通過測定和監(jiān)控使甲醇、甘油或葡萄糖濃度控制在0.1%-0.5%。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體生長 采用比濁法，使用紫外分光光度計測定。將發(fā)酵液樣品經(jīng)適當稀釋，測定其在650 nm下的光密度OD650；測定細胞干重時，將從發(fā)酵罐中所采具有不同OD650值的樣品，離心洗滌2次，80℃下烘干至恒重，得到表達雞α-干擾素重組畢赤酵母的細胞干重與OD650之間的關(guān)系為：Y（DCW）= 0.417 OD650。

1.2.2.2 抗病毒活性測定 測定用細胞和病毒由南京農(nóng)業(yè)大學贈送，細胞為雞胚成纖維細胞（CEF），病毒為水泡性口炎病毒（VSV）。測定方法參照參考文獻［6］的抗病毒活性測定方法。

1.2.2.3 甘油濃度測定 采用HPLC法，Agilent 1100 液相色譜儀，C18反向柱，5 μm，4.6 mm× 250 mm；流動相：70%乙腈，30%水；流速：0.6 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：5 μL；檢測器：示差折光檢測器。

1.2.2.4 甲醇濃度測定 參照文獻方法［7］用氣相色譜儀測定。

1.2.2.5 葡萄糖濃度測定 利用SBA-40生物傳感儀測定（山東省農(nóng)業(yè)科學院）。

2 結(jié)果

2.1 pH對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

在10 L罐發(fā)酵水平，維持不同的pH條件下，考察其對干擾素表達及菌體合成的影響。結(jié)果（圖1）顯示，維持pH5.5條件下，發(fā)酵42 h，細胞干重達到25.5 g/L，產(chǎn)物雞α-干擾素IFN-α抗病毒活性達

到2×106IU/mL。雖在pH6.0條件下獲得的細胞干重與pH5.5相比更高，但產(chǎn)物抗病毒活性相對較低，所以選擇維持pH5.5進行后續(xù)試驗。

圖1 pH對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

2.2 溫度對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

通過考察不同溫度條件下對菌體合成和產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性的影響發(fā)現(xiàn)，維持全過程溫度28℃時，產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性最高，可達到2×106IU/mL（圖2）。

圖2 溫度對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

2.3 裝液量對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

鑒于裝液量對于工程菌發(fā)酵的重要性（影響營養(yǎng)物及氧氣的傳遞性能），考察了10 L發(fā)酵罐中不同裝液量（80%、70%、60%、50%和40%）對菌體合成及雞α-干擾素表達的影響。結(jié)果（圖3）表明，隨著裝液量的增加菌體合成量大致呈下降趨勢。而在裝液量為50%條件下，在獲得較大菌體量的同時，產(chǎn)物獲得了最高的抗病毒活性（3×106IU/mL）。在40%裝液量條件下的發(fā)酵液經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)大量細胞碎片的存在，推測原因可能是在相同攪拌功率條件下，隨著裝液量的減少，P/V（單位體積功率系數(shù)）將增大，從而對菌體細胞產(chǎn)生較大的剪切力，造成細胞破碎。

圖3 裝液量對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

2.4 碳源流加模式對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

考察不同流加模式對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響，結(jié)果（表1）顯示，以模式1，即甘油和甲醇混合（流加體積速率比為20∶1）脈沖流加，在獲得最大菌體量的同時，獲得雞α-干擾素最大的抗病毒活性為5.1×106IU/mL。

表1 碳源流加模式對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響

2.5 規(guī)模放大試驗

將10 L自控發(fā)酵罐的補料批次發(fā)酵過程（圖4）顯示，在50 L規(guī)模進行放大，重復20批。結(jié)果顯示，與10 L罐上的各項表觀參數(shù)相比，50 L罐發(fā)酵過程各項目標參數(shù)與10 L沒有較大的變化，結(jié)果重現(xiàn)性較好，生產(chǎn)過程各項參數(shù)較為穩(wěn)定（表2），且目的蛋白表達量穩(wěn)定（圖5），具有工業(yè)化生產(chǎn)的實際價值。

圖4 10 L自控發(fā)酵罐的補料批次發(fā)酵過程圖

表2 50 L發(fā)酵規(guī)模畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素過程穩(wěn)定性

圖5 50 L發(fā)酵罐中不同批次重組雞α-干擾素的表達

3 討論

目前利用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行雞I型干擾素（IFN-α）表達的報道已經(jīng)屢見不鮮，且其表達產(chǎn)物IFN-α對VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段具有確切的抑制作用［4，5］。溫度對畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)表達外源蛋白表達過程有極大的影響，過高的溫度會導致細胞代謝活性低（表現(xiàn)為過低的AOX活性），而過低的溫度同樣會帶來大量毒性物質(zhì)甲醛和過氧化氫積累［8，9］。在通常條件下，畢赤酵母利用甲醇表達外源蛋白過程中，甲醇同時充當誘導劑、碳源和能源的角色，直接導致能量再生速度不足限制目標蛋白的高效可持續(xù)表達；另一方面，甲醇代謝途徑過重的能量再生運轉(zhuǎn)負擔還會誘發(fā)中間毒性代謝產(chǎn)物（如甲醛）的生成積累，造成細胞過早衰亡［10］。

一般來說，重組畢赤酵母進行干擾素表達多采用補料-分批發(fā)酵形式進行，以指數(shù)形式補料使細胞以恒定速率生長，易于實現(xiàn)菌體生長的高密度，從而對重組蛋白的表達十分有利。此過程分為兩個階段：高密度流加培養(yǎng)和蛋白誘導表達階段。對于高密度流加培養(yǎng)過程報道主要集中在基于比生長速率的最優(yōu)甲醇流加控制以及甲醇濃度的控制方面。而高生長速率條件下，溶解氧通常是一個限制性因素，通過富氧提供、提高罐壓、保持培養(yǎng)液中甲醇低濃度等手段來維持和改善細胞呼吸代謝往往成為現(xiàn)有生產(chǎn)過程控制的主要方式。但提供富氧和提升罐壓，往往會造成細胞毒性和呼吸代謝受到抑制等問題。由于甲醇充當碳源、能源和誘導劑的三重角色，致使維持培養(yǎng)液中甲醇低濃度對能量/呼吸代謝也是無益的（外源蛋白的形成和生產(chǎn)過程中需要消耗大量的能量，能量的供給和儲存與外源蛋白表達的同化合成途徑嚴重地互相依存），同時甲醇濃度過低誘導強度不夠，蛋白表達效率將受到影響［11-13］。

本研究從pH、溫度、裝液量以及碳源流加模式等方面對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的生產(chǎn)工藝進行了摸索，并進行了發(fā)酵規(guī)模的放大試驗，以期獲得適用于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝條件。而基于高密度環(huán)境條件下的能量/呼吸代謝的響應(yīng)機理正在研究之中。

4 結(jié)論

本研究首先在10 L罐規(guī)模條件下考察了pH、溫度、裝液量以及碳源流加模式對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α-干擾素的影響，確定了最優(yōu)的生產(chǎn)工藝：在pH5.5、28℃、40%裝液量條件下，當初始碳源耗盡的情況下，進行甘油和甲醇混合（流加體積速率比為20∶1）脈沖流加，產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性最高，可達3×106IU/mL。在50 L發(fā)酵罐規(guī)模條件下，將該工藝進行放大，重復20批，結(jié)果表明此過程重復性較好，且目的蛋白表達量穩(wěn)定，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實際應(yīng)用價值。

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（責任編輯 馬鑫）

The Improvement of Chicken Alpha Interferon Expression by a Recombinant Pichia pastoris with Cultural Condition Optimization

Jiang Zhengjun1Liu Shuhai1Wang Maochao1Cheng Quanming1Huang Jin1，2
（1. Shandong Huachen Bio-tech Co.，Ltd，Weifang 261061；2. College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014）

To achieve excellent performance of Pichia pastoris for chicken alpha interferon expression, pH value, temperature, culture volume and carbon source feeding pattern were optimized. The maximum anti-virus activity（3×106IU/mL）was harvested in the conditions of pH5.5, 28℃, and 40% culture volume in 10 L fermentor, as well as the glycerol-methanol（20∶1, V/V）co-feeding pattern was conducted when carbon source exhausted. This process was successfully scaled up to 50 L fermentor and the fermentation performance was also steady, which could be taken advantage of for its industrial application.

Pichia pastoris Chicken alpha interferon Optimization Up-scale

2013-12-03

山東省2011年科技發(fā)展計劃資助項目（2011GGH22109）

姜正軍，男，碩士，高級工程師，研究方向：蛋白類藥物；E-mail：sinostar5555@gmail.com

黃金，博士，副教授，研究方向：蛋白類藥物研發(fā)；E-mail：huangjin979@zjut.edu.cn