胡小平 陳辦成 邵 勇 張 杰 唐莉華 于 波

IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)與銀屑病發(fā)病的相關(guān)性

胡小平 陳辦成 邵 勇 張 杰 唐莉華 于 波?

目的: 確定白介素－9(IL－9)和白介素－10(IL－10)基因拷貝數(shù)與銀屑病發(fā)病的相關(guān)性。方法: 采用RT－PCR對424例銀屑病患者和424名健康者的IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異進(jìn)行檢測和比較。結(jié)果: 銀屑病患者的IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)較健康人基因拷貝數(shù)顯著增高(P＜0.05)。結(jié)論: IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)增加可能會增加對銀屑病的易感性。

白介素－9； 白介素－10； 基因拷貝數(shù)； 銀屑病

銀屑病是一種在多基因遺傳背景下,由T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與導(dǎo)致的慢性炎癥性皮膚病,且細(xì)胞因子的平衡失調(diào)與該病密切相關(guān)。1

基因拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)是遺傳多樣性的主要表現(xiàn)形式之一,它可以影響免疫系統(tǒng),從而增加人類自身免疫性疾病的易感性。2研究發(fā)現(xiàn),CNVs和銀屑病嚴(yán)重程度具有明顯的相關(guān)性。3近年來,細(xì)胞因子IL－9和IL－10在銀屑病發(fā)病中的作用受到關(guān)注。目前尚無關(guān)于IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異與銀屑病發(fā)病之間關(guān)系的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 研究對象 銀屑病患者組424例(男216例,女208例；年齡2～70歲,平均28.5±12.4歲)來自2008年6月至2012年6月北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科門診,均符合尋常型銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中進(jìn)行期患者236例,靜止期患者108例,消退期患者80例。健康對照組424名(男220名,女204名；年齡4～65歲,平均28.1±7.8歲)選自同期在北京大學(xué)深圳醫(yī)院健康體檢者,無銀屑病家族史,無腫瘤、自身免疫性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 抽取424例銀屑病患者及424名健康對照者外周靜脈血(檸檬酸抗凝)5 m L,3000 rpm分離血細(xì)胞,取100μL血細(xì)胞,用全血基因組提取試劑盒(由深圳依諾金生物技術(shù)有限公司提供)提取基因組DNA。DNA提取步驟如下:向100μL血細(xì)胞中加入300μL細(xì)胞復(fù)合裂解液,混勻器震蕩20 s,置65℃水浴中反應(yīng)20 min。再加入200μL蛋白沉淀液,上下顛倒5～6次使兩者混勻,13 000 g離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入等體積異丙醇,混勻后13 000 g離心10 min,傾去上清。最后加入200μL 70%的乙醇溶液,來回倒置清洗管壁, 13 000 g,離心10 min,移去乙醇自然干燥離心管,加入33μL DNA溶解液。用紫外分光光度儀測定DNA純度及濃度,置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 運(yùn)用熒光定量PCR儀擴(kuò)增待檢測的基因片段IL－9和IL－10。選取保守區(qū)RNaseP片段作為熒光定量內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) IL－9引物序列:PF:5′－CTGTGAACAGCCATGCAAC－3′；PR:5′－AAGACTCTTCAGAAATGTCAGC－3′。IL－10引物序列:PF:5′－AAGCTGTTTCCATAGGGTGA－3′；PR:5′－CCAAGCCCAGAGACAAGATA－3′。RNaseP引物序列:5′－ATGTCCCTTGGGAAGATCAG－3′；PR:5′－CTGACCTCAAGCAGCTCTGT－3′。

1.2.2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增 反應(yīng)總體系10μL,含10mM dNTPmix 0.2μL,Taq Buffer1μL,SYBRGreen (50×)0.1μL,MgCl22.4μL,Taq DNA pol 0.1μL, Primer F(10 nM)0.2μL,Primer R(10 nM)0.2μL,模板DNA 2μL(約10 ng),ddH2O 3.8μL。PCR條件:95℃預(yù)變性3 min,1個循環(huán)；95℃變性30 s,55℃退火20 s,72℃延伸20 s,讀板,共40個循環(huán)；溶解曲線溫度從65℃～95℃,每升高0.5℃讀板1 s,。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別統(tǒng)計(jì)分析銀屑病患者組和健康對照組的IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn),借助SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較。以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)?；蚩截悢?shù)分類參考文獻(xiàn)中的方法。4

2 結(jié)果

銀屑病患者組的IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)比健康對照組升高,兩組拷貝數(shù)變異構(gòu)成比較有顯著性差異,均P＜0.05。見表1、2。

銀屑病患者組中進(jìn)行期和消退期患者的IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異構(gòu)成無顯著性差異,均P＞0.05。見表3、4。

表1 銀屑病患者與健康對照者IL－9基因拷貝數(shù)比較

表2 銀屑病患者與健康對照者IL－10基因拷貝數(shù)比較

表3 銀屑病患者進(jìn)行期與消退期IL－9基因拷貝數(shù)比較

表4 銀屑病患者進(jìn)行期與消退期IL－10基因拷貝數(shù)比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),IL－9和IL－10主要由一種新型CD4＋T細(xì)胞亞群—Th9細(xì)胞分泌,在炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的作用。5在自身免疫性疾病中,IL－9是一種促炎細(xì)胞因子,可以使得炎癥細(xì)胞的數(shù)量上升并分泌一些炎癥介質(zhì),促進(jìn)炎癥的發(fā)生。6IL－10是一種抑制炎癥的細(xì)胞因子,主要通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞、肥大細(xì)胞和粒細(xì)胞的增殖和分化、抑制Th1細(xì)胞分泌干擾素IFN－γ和IL－2來發(fā)揮生物學(xué)作用,抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。7

IL－9和IL－10在銀屑病發(fā)病中均具有重要作用。大量研究證實(shí)IL－10在銀屑病皮損中的表達(dá)明顯降低是銀屑病皮損形成的重要原因,用IL－10相關(guān)制劑治療進(jìn)行期銀屑病可取得明顯療效。9在對IL－ 10啟動子多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn),IL－10啟動子區(qū)包含高度多態(tài)性的微衛(wèi)星等位基因與家族性早年發(fā)病的銀屑病相關(guān),推測其啟動子拷貝數(shù)變異與銀屑病發(fā)病的遺傳易感性有關(guān)。10

本研究結(jié)果顯示,銀屑病患者組IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)明顯高于健康對照組,兩組結(jié)果比較有明顯差異,說明IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異與銀屑病發(fā)病有明顯的相關(guān)性。而對進(jìn)行期和消退期患者的IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異進(jìn)行比較顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,進(jìn)一步從不同角度說明IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異增加了罹患銀屑病的遺傳易感性。本課題組在對白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)性分析的研究中發(fā)現(xiàn), IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異與白癜風(fēng)發(fā)病有明顯的相關(guān)性,11故本研究結(jié)果尚不能說明IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異是銀屑病發(fā)病的遺傳特異性因素。

CNVs可能通過直接改變基因的拷貝數(shù)來改變一個基因的表達(dá)“量”,生成截短蛋白,或者影響基因的調(diào)控序列來影響基因的表達(dá),12從而造成個體間表型的差異,包括一些復(fù)雜疾病的發(fā)生。那么,銀屑病患者IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異是否影響了IL－9和IL－10的表達(dá)量或其功能的表達(dá),從而促進(jìn)了銀屑病的發(fā)生發(fā)展,值得深入研究。

總之,基于銀屑病是一種多基因遺傳背景下的細(xì)胞免疫性疾病的理論,從遺傳學(xué)角度出發(fā),研究銀屑病的遺傳易感基因,是從根本上揭示該疾病病因以及發(fā)病機(jī)制的重要途徑。IL－9和IL－10基因拷貝數(shù)變異與銀屑病發(fā)病有明顯的相關(guān)性,兩者拷貝數(shù)增加可能會增加銀屑病的易感性,這對于疾病的篩查和預(yù)防具有重要的臨床意義。

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(收稿:2013－07－08 修回:2013－08－12)

Relationship of IL－9 and IL－10 gene copy number variationsw ith psoriasis

HU Xiao-ping,CHEN Ban-cheng,SHAO Yong,etal.Department ofDermatology,Shenzhen Hospital,Beijing University,Shenzhen,518036

Objective:To determine the association of interleukin－9(IL－9)and interleukin－10(IL－10) gene copy number variations with psoriasis.Methods:Determination of gene copy number of IL－9 and IL－10 was achieved by RT－PCRmethod and compared between 424 psoriatic patients and 424 healthy controls.Results:The IL－9 and IL－10 gene copy numberwas higher in the psoriatic patients than in the healthy controls (P＜0.05).Conclusion:The increasing of IL－9 and IL－10 gene copy numbersmay increase the susceptibility to psoriasis.

interleukin－9；interleukin－10；gene copy number；psoriasis

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號:s2012040006694)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(編號:B2012329)

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號:201203035)

北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科,廣東深圳,518036

?通信作者