張曉霞，趙子健，戴一凡，李 斌，米樹(shù)華*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院特需醫(yī)療科，北京100029;2.南京醫(yī)科大學(xué)代謝疾病研究中心，江蘇南京210029)

ω-3 多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids PUFAs)具有抗炎、改善血脂及減輕動(dòng)脈硬化等多種作用。其與ω-6 PUFAs 在體內(nèi)的平衡對(duì)心血管系統(tǒng)的正常功能具有重要意義［1-2］。普通動(dòng)物源性脂肪含ω-3PUFAs 甚少，增加常見(jiàn)植物油脂攝入對(duì)心臟多不飽和脂肪酸比例的影響尚缺乏研究。本研究初步探討以植物油脂代替動(dòng)物脂肪攝入對(duì)心肌ω-6/ω-3多不飽和脂肪酸比例以及缺血再灌注時(shí)心肌損傷程度的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠80 只，體質(zhì)量(25 ±2)g［斯貝福公司，合格證號(hào):SCXK(京)2011-0004］。飼料(華阜康公司)。氯化三苯四氮唑(TTC)、伊文思藍(lán)、不飽和脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega 公司)。Real-time PCR 試劑盒(寶生物工程公司)。TNF-α 及IL-1 ELISA 試劑盒(BG 公司)。

1.2 動(dòng)物分組與處理

小鼠隨機(jī)分為普通飲食組(n =40)、植物油脂組(n=40)。植物油脂組去除普通飼料中部分動(dòng)物脂肪，按照25 g/kg 添加大豆油和花生油(1∶1)。飼養(yǎng)1 個(gè)月后，每組隨機(jī)取8 只小鼠作為基線對(duì)照，行假手術(shù)，開(kāi)胸后只穿線，不結(jié)扎。其余小鼠常規(guī)建立心臟缺血再灌注模型［3］。缺血30 min，再灌注3 h。

1.3 TTC 染色

心臟去除心房和大血管，0.9%氯化鈉注射液清洗，吸干水分，－20 ℃冰箱冷凍固定20 min，自心尖起每隔1 mm 垂直于心臟長(zhǎng)軸將心臟切成薄片，置于37 ℃1% TTC 溶液中，37 ℃水浴10 min。之后，將心肌薄片置于體式顯微鏡10 倍放大后拍照。尼康圖像分析儀進(jìn)行分析。測(cè)量左心室面積(area of left ventricle LV)、缺血面積(area at risk AAR 伊文思藍(lán)未著色，TTC 染為磚紅色)和梗死面積(infarction size IS TTC 染色呈灰白色)。缺血面積% =AAR/LV×100%，梗死面積% =IS/AAR×100%。

1.4 線粒體呼吸控制率的檢測(cè)

將心臟用0.9%氯化鈉注射液清洗，剪下左心室未被伊文斯蘭著色的心肌，冰預(yù)冷勻漿介質(zhì)中剪碎，輕柔勻漿，4 ℃，600 ×g 離心10 min 后，取上清液再以4 ℃，8 000 ×g 離心15 min，勻漿介質(zhì)洗滌，沉淀即為純化的心肌線粒體，加適量勻漿介質(zhì)重新懸浮，雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度。耗氧檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定溫度25℃，調(diào)節(jié)最大相對(duì)氧濃度和氧零值，線粒體終濃度1 g/L，記錄基線后加入外源底物琥珀酸(2.5 mmol/L)，出現(xiàn)IV 態(tài)呼吸，記錄2 min 后，加入二磷酸腺苷(ADP，100 mmom/L)，出現(xiàn)III 態(tài)呼吸，計(jì)算線粒體呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)即III 態(tài)與IV 態(tài)呼吸速率之比，反應(yīng)線粒體膜完整性和氧化磷酸化的耦聯(lián)程度。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)缺血區(qū)TNF-α mRNA的表達(dá)

采用Trizol 提取、酚仿抽提乙醇重新沉淀的方法提取缺血區(qū)心肌組織總RNA，以Random primer為引物，按照試劑盒說(shuō)明書操作，以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)心肌中TNF-α 表達(dá)，以β-actin 做為內(nèi)參照物，根據(jù)CT 值計(jì)算TNF-α的相對(duì)表達(dá)量。引物:TNF-α 上游:5'-GTCCCCAA AGGGATGAGAAG-3'，下游:5'-CACTTGGTGGTTTG CTACGA-3';內(nèi)參照β-actin:上游:5'-GTCCCTCACC CTCCCAAAAG-3' 下游:5'-GCTGCCTCAACACCTCA ACCC-3'。

1.6 ELISA 法檢測(cè)缺血區(qū)心肌中TNF-α 及IL-1含量

心肌組織勻漿離心后，留取上清液，雙縮脲法進(jìn)行蛋白定量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF-α及IL-1 含量。

1.7 心肌ω-6 及ω-3 不飽和脂肪酸的測(cè)定

甲醇-氯仿提取心肌中的脂質(zhì)，以14% BF3/MeOH 酯化后進(jìn)行氣相色譜分析。起始溫度45 ℃4 min，然后以13 ℃/min 遞增至175 ℃，保持27 min。再以4 ℃/min 增加至215 ℃，保持35 min。通過(guò)將保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，分析脂肪酸含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心臟ω-6 及ω-3PUFAs 的含量

植物油脂組小鼠心臟ω-6PUFAs、AA 含量及ω-6/ω-3PUFAs 比例均顯著低于普通飲食組(P＜0.05)(表1)。

2.2 心肌梗死面積的比較

植物油脂組小鼠心肌梗死面積為31.5% ±4.5%，顯著低于普通組的50.1% ±3.8%(n =8，P＜0.01)(圖1)。

2.3 缺血區(qū)心肌線粒體呼吸控制率

植物油脂組線粒體RCR 顯著高于普通組(P＜0.05)，但均顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)(圖2)。

表1 心臟PUFAs 含量及ω-6/ω-3PUFAs 比例的比較Table 1 Comparison of the content of PUFAs(mg/ml)and the ratio of ω-6/ω-3PUFAs in the heart(±s，n=8)

表1 心臟PUFAs 含量及ω-6/ω-3PUFAs 比例的比較Table 1 Comparison of the content of PUFAs(mg/ml)and the ratio of ω-6/ω-3PUFAs in the heart(±s，n=8)

＊P＜0.05 compared with ordinary diet group.

groupLAAAEPADHAω-6/ω-3 ordinary diet5.16 ±1.901.72 ±0.630.17 ±0.06 2.90 ±1.512.38 ±0.38 plant oil2.61 ±0.50*0.87 ±0.17*0.12 ±0.011.65 ±0.411.99 ±0.18*

圖1 心肌梗死面積的比較Fig 1 Comparision of the infarction size(n=8)

圖2 呼吸控制率的比較Fig 2 Comparision of the respiration control rate(n=8)

2.4 缺血區(qū)心肌組織TNF-α mRNA 的表達(dá)及TNF-α 與IL-1 的蛋白含量

缺血再灌注后，普通組及植物油脂組小鼠心肌組織中TNF-α 的mRNA 表達(dá)均較缺血前顯著增高(P＜0.01)，而植物油脂組顯著低于普通組(P＜0.05)(圖3)。與缺血前相比，普通組和植物油脂組TNF-α 及IL-1 含量均顯著增高，而植物油脂組明顯低于普通組(表2)。

圖3 缺血區(qū)TNF-α mRNA 表達(dá)的比較Fig 3 Comparision of the expression of TNF-α mRNA in area at risk(n=6)

3 討論

ω-3PUFAs 可降低冠心病患者的病死率，減少心性猝死［4］。植物油富含單及多不飽和脂肪酸，以普通植物油為脂肪酸主要來(lái)源的飲食，對(duì)心肌ω-6/ω-3 不飽和脂肪酸比例以及心肌缺血再灌注時(shí)損傷程度的影響尚不明確。

表2 缺血區(qū)TNF-α 及IL-1 含量的比較Table 2 Comparision of the TNF-α and IL-1 in area at risk(±s，n=8)

表2 缺血區(qū)TNF-α 及IL-1 含量的比較Table 2 Comparision of the TNF-α and IL-1 in area at risk(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with the content before I/R;#P＜0.05 compared with the ordinary diet group.

ordinary diet groupplant oil group before I/Rafter I/Rbefore I/Rafter I/R TNF-α(pg/mg)6.50 ±0.7637.09 ±8.30*5.13 ±1.0923.27 ±9.61*#IL-1 (Pg/mg)9.09 ±1.2658.33 ±16.58*9.59 ±1.2139.03 ±10.37*#

本研究顯示，以未被加熱氧化的植物油代替飼料中的部分動(dòng)物脂肪成分，可降低心肌細(xì)胞膜ω-6/ω-3 多不飽和脂肪酸比例。其可能與動(dòng)物脂肪中含有較高比例的ω-6 不飽和脂肪酸、及多不飽和脂肪酸吸收后在體內(nèi)的不同分布有關(guān)。

ω-3 PUFAs 具有明顯的抗炎性反應(yīng)作用。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic Acid，EPA)可與花生四烯酸(arachidonic acid，AA)競(jìng)爭(zhēng)環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)和脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)的結(jié)合位點(diǎn)，影響前列腺素類化合物的代謝，生成無(wú)生物活性的血栓素A3(thromboxane A3，TXA3)。而由EPA 代謝而來(lái)的前列環(huán)素I3(prostacyclin I3，PGI3)卻具有同等強(qiáng)度的抗血小板聚集作用。同時(shí)，COX-1 和COX-2 代謝EPA 的效率只有AA 的10%～30%［1］。EPA 的LOX 代謝產(chǎn)物白細(xì)胞三烯B5(leucotriene B5，LTB5)的致炎作用也顯著弱于AA 來(lái)源的LTB4［2］。一些文獻(xiàn)報(bào)道了ω-3 PUFAs 可顯著改善體外循環(huán)術(shù)后炎性因子IL-6的升高［5］、抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)激活及其細(xì)胞因子表達(dá)［6］及抑制前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)刺激后基質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)過(guò)程［7］等。EPA 還可抵消3T3-L1 脂肪細(xì)胞中AA 導(dǎo)致的血管緊張素II 分泌［8］。

缺血再灌注損傷在某種程度上是一個(gè)強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)損傷過(guò)程。氧自由基的大量產(chǎn)生使心肌微粒體及質(zhì)膜上的脂加氧酶和環(huán)加氧酶激活，代謝AA 產(chǎn)生PGE2 及TXA2 等炎性因子。單核和巨噬細(xì)胞激活后產(chǎn)生大量TNF-α 和IL-1β，加速中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)心肌組織，釋放大量的氧自由基，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死和凋亡。本研究顯示，植物油脂組小鼠缺血區(qū)TNF-α 的mRNA 表達(dá)顯著下降，TNF-α 和IL-1β 蛋白含量顯著減低，提示炎癥過(guò)程被顯著抑制。植物油脂組小鼠線粒體呼吸控制率顯著改善，提示炎性反應(yīng)的減弱顯著改善了缺血區(qū)心肌線粒體的功能。線粒體功能的改善提高了心肌ATP 供應(yīng)、減少氧自由基的進(jìn)一步產(chǎn)生，對(duì)于改善再灌注損傷具有重要意義。

綜上，適當(dāng)以植物油代替動(dòng)物脂肪攝入可改善心肌ω-6PUFAs 和ω-3PUFAs 比值，改善心肌缺血再灌注損傷，其臨床意義有待進(jìn)一步研究。

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