楊 靜童中勝萬 喆陳 偉胡志敏李若瑜?

巢式PCR診斷甲真菌病中紅色毛癬菌和須癬毛癬菌

楊 靜1童中勝1萬 喆2陳 偉2胡志敏1李若瑜2?

目的: 評價巢式PCR診斷甲真菌病中紅色毛癬菌和須癬毛癬菌的敏感性和特異性。方法:液氮冷凍甲標本，微量法提取DNA，應(yīng)用特異性引物，巢式PCR方法擴增DNA。結(jié)果: 36例直接鏡檢和培養(yǎng)均為陽性的甲標本，培養(yǎng)顯示24例為紅色毛癬菌，12例為須癬毛癬菌。巢式PCR中First PCR 34例陽性，34例標本均產(chǎn)生了650 bp目的片段；Nest PCR 32例陽性，32例中有22例標本產(chǎn)生了137 bp的片段，為紅色毛癬菌；10例標本產(chǎn)生了102 bp的片段，為須癬毛癬菌。PCR敏感性為88.9%，特異性為100%。結(jié)論: 巢式PCR是一種快速、特異和敏感的診斷甲真菌病中紅色毛癬菌和須癬毛癬菌的方法。

甲真菌??； 巢式PCR

甲真菌病是指任何真菌引起的甲感染，包括皮膚癬菌、酵母菌、霉菌及混合感染，其中皮膚癬菌約占全部感染的67%～90%，而皮膚癬菌中約80%～90%為紅色毛癬菌和須癬毛癬菌。1－3目前國內(nèi)診斷的主要依據(jù)為真菌直接鏡檢和培養(yǎng)。前者不能鑒定到真菌的種類，陽性率只有50%～70%左右，且對檢驗人員的技術(shù)要求較高。而后者敏感性差、耗時長，培養(yǎng)需至少數(shù)天至數(shù)周才能判斷結(jié)果。而鏡檢和培養(yǎng)相結(jié)合的正確診斷率約為50%～75%，4導(dǎo)致1/4至1/2的甲真菌病無法早確診，甚至誤診，上述問題難以滿足臨床快速診斷和及時治療需要。為解決這個問題，我們利用液氮冷凍甲標本，微量法提取DNA，應(yīng)用特異性引物，巢式PCR擴增DNA的方法，在24 h內(nèi)對甲真菌病中的主要病原菌(紅色毛癬菌和須癬毛癬菌)做出診斷，且敏感性、特異性均較高。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本取自2010年10月至2011年8月武漢市第一醫(yī)院皮膚科及北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科臨床甲真菌病患者的病甲。實驗所用標準菌由北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 取材 取材前先用75%的乙醇消毒局部，然后刮取病變活動部位的甲屑，所得標本分為三部分，一部分用于鏡檢，另一部分接種于PDA培養(yǎng)基，其余部分置于無菌Ep管中以提取DNA。

1.2.2 臨床標本DNA的提取 將裝有標本的EP管放置于液氮中冷凍30 s，同時微型研磨棒(中國科學(xué)院微生物研究所提供)也在液氮中預(yù)冷。將EP管放置于試管架上，快速研磨30 s后再放置于液氮中冷凍30 s，再置于試管架上快速研磨。重復(fù)冷凍研磨操作，直到標本被研磨成細勻粉末。大塊標本先在研缽內(nèi)研碎后再放入EP管中冷凍研磨。每個裝有標本粉末的EP管中加入蛋白酶K，56℃水浴過夜，其間應(yīng)輕輕上下倒置數(shù)次，使其充分混合。之后采用QIAamp DNA investigator kit所提供的方法抽提DNA。參照菌株也用同一方法提取DNA。

1.2.3 引物的選擇與合成 引物采用文獻中針對大亞基28S rDNA的基因片段，5外引物(真菌通用引物):上游引物FUPa F1(5’－AAGCATATCAATAAGCGGAGG－3’)和下游引物FUPa R1(5’－GGTCCGTGTTTCAAGACGG－3’)。內(nèi)引物:紅色毛癬菌:上游引物TRUB F1(5’－CGTCGCCCGTGCACTG－3’)和下游引物TRUB R1(5’－GAGCGCGTTCCTCAGTCT－3’)；須癬毛癬菌:上游引物TMENT F1(5’－GTGCTCGTCGCCCGTGT－3’)和下游引物TMENT R1 (5’－GGCTATAAGACGTCCCG－3’)。

1.2.4 PCR擴增 采用巢式PCR檢測。首先應(yīng)用外引物進行第1次擴增(First PCR)，然后進一步應(yīng)用內(nèi)引物對第1次擴增的產(chǎn)物進行第2次擴增(Nest PCR)?？偡磻?yīng)體系如下:10×PCR Buffer 2.5μL，上游引物(10 pmol/L)各1μL，下游引物(10 pmol/L)各1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1μL，DNA 2μL，LATaq酶(5 U/μL)0.25μL，加入蒸餾水使體系總體積為25μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性，95℃15 min；變性，95℃30 s，退火，第1輪和第2輪反應(yīng)分別為54℃和56℃30 s，延伸，72℃30 s，共30個循環(huán)；再延伸，72℃15 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物回收純化及電泳 采用切膠純化的方法。步驟按Thermo公司silica Bead DNA Gel Extraction Kit進行。瓊脂糖凝膠電泳:取6μL反應(yīng)產(chǎn)物，2.5%瓊脂糖凝膠，100 v下電泳。

1.2.6 PCR特異性檢測 用上述引物同時擴增金黃色葡萄球菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白念珠菌的DNA，以觀察反應(yīng)的特異性。設(shè)置陰性對照(以蒸餾水替換模板DNA)和陽性對照(紅色毛癬菌和須癬毛癬菌標準菌株)。選擇所有擴增陽性的產(chǎn)物進行雙向測序。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，陽性率比較采用樣本t檢驗，取P＜0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

本組共收集標本36例，36例標本直接鏡檢和培養(yǎng)均為陽性。其中24例培養(yǎng)為紅色毛癬菌(66.7%)，12例培養(yǎng)為須癬毛癬菌(33.3%)。First PCR 34例陽性(圖1、2)，Nest PCR 32例陽性，其中22例標本經(jīng)PCR擴增可產(chǎn)生約137 bp目的片段，為紅色毛癬菌(經(jīng)測序及培養(yǎng)結(jié)果驗證)(圖3)；10例標本經(jīng)PCR擴增可產(chǎn)生約102 bp目的片段，為須癬毛癬菌(經(jīng)測序及培養(yǎng)結(jié)果證實)(圖4)。PCR檢出率為94.4%(34/36)，敏感性為88.9%(32/36)，特異性為100%[本實驗所用的真菌通用引物(外引物)可擴增出紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白念珠菌、短帚霉、曲霉等常見的甲真菌，未擴增出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等陰性對照，實驗所用的特異性引物(內(nèi)引物)可特異性的擴增出紅色毛癬菌和須癬毛癬菌，未擴增出白念珠菌、短帚霉、曲霉、金黃色葡萄球菌等陰性對照]。

圖1 臨床甲真菌病甲標本First PCR擴增后電泳圖

圖2 臨床甲真菌病甲標本First PCR擴增后電泳圖

圖3 臨床甲真菌病甲標本Nest PCR擴增后電泳圖

圖4 臨床甲真菌病甲標本Nest PCR擴增后電泳圖

3 討論

甲真菌病是皮膚科常見病，但其正確的診斷卻不盡人意。診斷不準確的原因:第一，甲病比較復(fù)雜，可以是真菌引起，也可以是細菌、遺傳、免疫、外傷等因素引起，也可能是其他疾病伴發(fā)甲病變。據(jù)調(diào)查只有約50%是真菌感染所致，僅根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷甲真菌病容易誤診。第二，真菌學(xué)鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果是確診本病的主要依據(jù)，但直接鏡檢和培養(yǎng)的陽性率不高，且前者不能鑒定到真菌的種類，后者敏感性差，耗時。

近年來分子生物學(xué)技術(shù)已滲透至科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，其中聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)因具有簡便、省時、敏感性高、特異性好等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于許多學(xué)科。PCR的技術(shù)有很多，如隨機擴增多態(tài)DNA分析(RAPD)，6限制性酶切分析(RFLP)，7，8巢式PCR，9，10(GACA)4引物PCR，實時定量PCR(Real－Time PCR)，11，12探針與DNA印跡雜交13等等。這些技術(shù)的出現(xiàn)使得真菌感染的早期診斷成為可能，繼續(xù)提高敏感性和特異性將有可能使它作為臨床快速診斷的方法之一。PCR技術(shù)已在部分真菌病的分類鑒定和親緣關(guān)系分析中得到應(yīng)用，14，15但很少用于臨床病原真菌的檢測與診斷，主要是因為臨床標本中真菌DNA提取困難，限制了它的應(yīng)用。16純菌中提取DNA較容易，但甲組織由于本身質(zhì)地堅硬不易破碎，給真菌的破壁帶來了困難，再加上甲中其他成分多，病原菌量少且分散，就會導(dǎo)致PCR反應(yīng)無法得到結(jié)果。我們首次應(yīng)用液氮冷凍的方法，先將甲標本冷凍變脆，再用微型研磨棒研磨，能將甲盡可能地磨碎，促進真菌細胞的破壁，實驗證實，此方法大大增加甲真菌DNA提取的量，有效可行。

巢式PCR是指利用兩套PCR引物對目的基因進行兩輪PCR擴增反應(yīng)。在第1輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進行第2輪擴增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性，增加了檢測的敏感性(有研究較普通PCR高近百倍)，另又有兩對PCR引物與檢測模板配對，增加了檢測的特異性。故巢式PCR更適合于甲真菌病中少量真菌DNA的擴增。因核糖體小亞基(rRNA)的編碼基因保守性強，一般適用于種以上分類水平的研究，大亞基的編碼基因中含較多的可變區(qū)基因，全序列分析后能用作各分類水平的研究，故本項目采用針對核糖體大亞基28S rRNA的編碼基因片段設(shè)計出的特異性引物，通過巢式PCR的兩次擴增，達到快速準確鑒定甲真菌病病原菌的目的。

本實驗應(yīng)用了真菌通用引物和甲真菌中最常見的兩種致病真菌紅色毛癬菌和須癬毛癬菌的特異性引物，經(jīng)實驗證實，敏感性和特異性均好(PCR敏感性為88.9%，特異性為100%)。本實驗36例陽性標本First PCR后有34例陽性，擴增出紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白念珠菌、短帚霉、曲霉的DNA，未擴出大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的DNA，故First PCR后即可鑒定出是否為甲真菌感染。有2例標本(培養(yǎng)為紅色毛癬菌)First PCR無陽性結(jié)果，可能系所取的甲標本量太少，DNA沒有提出或提出的量太少所致。Nest PCR后有32例陽性，未擴出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌、曲霉的DNA，表明紅色毛癬菌和須癬毛癬菌的引物是特異的。仍有2例First PCR陽性但未擴出特異性片段(2例須癬毛癬菌)，是否可能因這2例菌株在種內(nèi)發(fā)生了變異或為其他的亞種，我們進行了測序，發(fā)現(xiàn)這2株菌株為趾間毛癬菌的結(jié)節(jié)變種。本研究所用方法在24 h內(nèi)即可完成從標本處理至結(jié)果判定全過程，且具有較高的敏感性和特異性。但本實驗樣本例數(shù)較少，統(tǒng)計結(jié)果可能有偏差，還需進一步增加樣本量以得出更為可靠的結(jié)論。另外，本實驗設(shè)計的引物種類較單一，我們將在下一步的研究中設(shè)計甲真菌病中其他致病菌的特異性引物，并在大樣本的檢測中觀察結(jié)果，使甲真菌病的快速診斷更加嚴謹和完善。

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(收稿:2013－08－22 修回:2013－10－30)

Nested PCR in the diagnosis of Trichophyton rubrum and Trichophytonmentagrophytes infections in onychom ycosis

YANG Jing，TONG Zhong-sheng，WAN Zhe，et al.Department ofDermatology，F(xiàn)irst Hospital ofWuhan，Wuhan，430022

Objective:To evaluate the sensitivity and specificity of nested PCR in the diagnosis of T. rubrum and T.mentagrophytes infections in onychomycosis.Methods:Nail specimenswere frozen in liquid nitrogen and the DNA extracted by micro－method.The target fragments were obtained by nested PCR with specific primers for T.rubrum and T.mentagrophytes respectively.Results:The group included 36 onychomycosis specimens，in which the direct examination of the fungi and culture resultswere positive(T.rubrums in 24 and T.mentagrophytes in 12 specimens).In nestPCR，34 specimens in the first PCR and 32 in the nest PCR were detected positive.The all positive specimens detected by first PCR produced 650 bp target fragments.A-mong the 32 nest PCR positive specimens，22 specimens produced 137 bp target fragments for T.rubrum and 10 produced 102 bp target fragments for T.mentagrophytes.The sensitivity of nested PCR was 88.9%and the specificity achieved 100%.Conclusion:This nest PCR is rapid，sensitive and specific in detection of T. rubrum and T.mentagrophytes infections in onychomycosis.

onychomycosis；nested PCR

湖北省自然基金(編號:2011CDB303)

1武漢市第一醫(yī)院皮膚科，武漢，430022

2北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，北京，100034

?通信作者