[摘要] 目的 探討醛固酮瘤CYP11B2基因第2內含子（intron 2）轉位與醛固酮瘤患者發(fā)病之間的關系。 方法 應用PCR檢測醛固酮瘤（66例）、醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織（38例）和正常腎上腺組織（14例）CYP11B2基因intron 2多態(tài)性（野生型/轉位型）。 結果 在醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2轉位發(fā)生率為31.81%，醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織為20.05%，正常腎上腺組織為14.29%，三者之間無統計學差異。 結論 醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2轉位與醛固酮瘤的發(fā)生無顯著關聯。

[關鍵詞] CYP11B2；intron 2轉位；醛固酮瘤

[中圖分類號] R736.6 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）05-0129-02

醛固酮瘤是原發(fā)醛固酮增多癥中最常見的一種，共同的特點是醛固酮的自主分泌及腎素被抑制。醛固酮的自主分泌是人們研究的熱點，人們已從基因水平上展開研究，CYP11B2基因的改變可能導致醛固酮瘤的發(fā)生，CYP11B2基因intron 2常常與CYP11B1基因intron 2發(fā)生轉位，本實驗就是研究CYP11B2基因intron 2轉位與醛固酮瘤發(fā)病之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2006年5月～2007年11月在武漢同濟醫(yī)院行手術切除并有病理證實為醛固酮瘤患者腺瘤標本66例，醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織38例和正常腎上腺組織（取自腎癌患者腎上腺）14例，-80℃保存。其中醛固酮瘤患者腺瘤標本女30例，男36例，年齡16～72歲。腫瘤組織全部取自腺瘤中央部分，每個標本組織重約25 mg。

1.2 DNA提取

用DNeasy試劑盒（德國Qiagen公司）按照說明提取DNA，用比色法檢測其濃度，-20℃保存。

1.3 PCR檢測

Intron 2野生型和轉位型基因多態(tài)性檢測采用2個獨立的PCR反應。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成，野生型基因上游引物5TGGAGAAAAGCCCTACCCTGT-3，下游引物5-AGGAACCTCTGCACGGCC-3；轉位型基因上游引物5-CAGAAAATCCCTCCCCCCTA-3，下游引物5-AGGAACCTCTGCACGGCC-3。PCR反應體系25 μL，按照反應體系：Taq酶master mix 12.5 μL，DNA 1 μg，primer 2 μL加水至25 μL。按反應條件94℃ 30 s，62℃ 15 s，72℃ 22 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min擴增目的片段。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠及130 V電壓持續(xù)電泳30 min，紫外燈下觀察電泳帶，擴增片段大小約為418 bp。

1.4 統計學方法

采用SPSS12.0統計學軟件包，應用χ2檢驗進行數據處理，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

PCR結果：野生型和轉位型擴增片段大小均為418 bp，在Marker的400～500 bp之間靠近400 bp處可見擴增片段，只有野生型片段者為WW型，只有轉位型片段者為CC型，野生型和轉位型片段均有則為WC型。PCR結果如圖1。

圖1 PCR結果（C為轉位型，W為野生型）

醛固酮瘤患者66例，WW型45例，WC型18例，CC型3例。醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織38例中WW型30例，WC型8例，CC型0例；正常腎上腺組織（14例）WW型12例，WC型2例，CC型0例。在醛固酮瘤CYP11B2基因intron 2轉位發(fā)生率為31.81%，醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤組織為20.05%，正常腎上腺組織為14.29%，醛固酮瘤與醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤χ2=1.808，醛固酮瘤與正常組織χ2=0.983；醛固酮瘤腫瘤旁腺瘤與正常組織χ2=0.008，P均>0.05。

3 討論

原發(fā)性醛固酮增多癥（簡稱原醛）是指由于腎上腺皮質分泌過多的醛固酮而引起潴鈉排鉀，血容量增多而抑制了腎素活性的一種病癥，臨床表現為高血壓和低血鉀綜合征群，腎上腺醛固酮瘤（APA，又稱Conn綜合征）是其最常見一種。醛固酮在球狀帶由醛固酮合成酶催化合成，研究發(fā)現醛固酮合成酶基因mRNA在醛固酮瘤中呈現高表達[1]。醛固酮合成酶基因的改變可能引起其mRNA在醛固酮瘤中呈現高表達。11B羥化酶在束狀帶催化合成皮質醇。但是實驗中我們在醛固酮瘤中也發(fā)現了CYP11B1基因的表達[1]。說明皮質醇合成酶在醛固酮合成過程中可能有一定的作用，并且CYP11B1和CYP11B2基因常常發(fā)生聯系。

有人對醛固酮瘤組織中和外周血中CYP11B2基因進行測序并沒有發(fā)現在這些基因編碼區(qū)有突變的地方[2]，mRNA是由DNA經hnRNA剪接而成，基因表達時，其外顯子和內含子均轉錄到hnRNA，hnRNA在移出細胞核前將內含子等部分剪除轉變?yōu)閙RNA?，F代研究發(fā)現內含子可影響基因的表達，也可以增加mRNA的穩(wěn)定性。內含子在基因表達中的作用愈來愈受到人們重視。

CYP11B1和CYP11B2基因位于同一基因，相距很近，高度同源，二者的第二位內含子常常發(fā)生轉位。CYP11B1基因的二號內含子轉位到CYP11B2基因的第二內含子上，可能會引起CYP11B2基因轉錄發(fā)生變化，但是具體還不清楚。不是每個醛固酮瘤患者CYP11B1基因的二號內含子轉位都到CYP11B2基因的第二內含子上，其發(fā)生率報道不一，Inglis[3]研究了27例APA中intron 2多態(tài)性在原醛和正常人群中的差異，發(fā)現intron 2轉位型基因（約70%）明顯高于正常。Jerome等[4]在高血壓患者中研究發(fā)現在高ARR值[>145 mol/（L·ng）]患者中intron 2轉位型基因明顯高與低ARR值患者。但是在我們的實驗中并未發(fā)現APA患者intron 2轉位型基因高于正常人，它也與腺瘤旁腎上腺組織無明顯差別，這種結果差別也可能與人種或研究數量有關。在正常人群中也發(fā)現CYP11B2基因intron 2轉位，說明CYP11B2基因intron 2轉位與CYP11B2基因mRNA高表達并無必然直接聯系。CYP11B2基因intron 2轉位與其啟動子區(qū)-344T/C位點存在連鎖不平衡性。Inglis[3]發(fā)現APA中CYP11B2基因intron 2轉位與其啟動子區(qū)-344T/C位點有顯著連鎖不平衡性（P < 0.01），Jerome等[4]報道在高血壓并高ARR患者中CYP11B2基因intron 2轉位與其啟動子區(qū)-344T/C位點有顯著連鎖不平衡性（P < 0.01）。不排除CYP11B2基因intron 2轉位是通過與其有連鎖不平衡性位點即啟動子區(qū)-344T/C位點起作用。但是現在關于-344T/C位點報道結果也不一致。我們發(fā)現C等位點與醛固酮瘤患者高醛固酮血癥有關[5]。有人則認為T等位點與高醛固酮血癥有關[6]；也有人認為CYP11B2基因啟動區(qū)-344T/C等位點C/T沒有顯著性差別[7]。

所以，雖然CYP11B2基因intron 2轉位是CYP11B2基因上常見突變，但是本研究發(fā)現其與APA患者血中高醛固酮無顯著關聯。

[參考文獻]

[1] 鄧西元，歐陽金芝，王保軍，等. 11β羥化酶、醛固酮合成酶和類固醇合成因子基因在醛固酮瘤中的表達[J]. 中華實驗外科雜志，2008，25（10）：1350.

[2] Takeda Y，Furukawa K，Inaba S，et al. Genetic analysis of aldosterone synthase in patients with idiopathic hyperald osteronism[J]. Clin Endocrinol Metab，1999，84（5）：1633-1637.

[3] Inglis GC，Plouin PF，Friel EC，et al. Polymorphic differences from normal in the aldosterone synthase gene （CYP11B2） in patients with primary hyperaldosteronism and adrenal tumour （Conns syndrome）[J]. Clin Endocrinol（Oxf），2001，54（6）：725-730.

[4] Jerome N，David B，Lucas A，et al. A biallelic gene polymorphism of CYP11B2 predicts increased aldosterone to rennin ratio in selected hypertensive patients[J]. Clin Endocrinol Metab，2003，86（6）：2495-2500.

[5] 鄧西元，張旭. 醛固酮瘤CYP11B2基因C-344T位點單核苷酸多態(tài)性與其發(fā)病關系[J]. 現代泌尿外科雜志，2010， 15（5）：336-337，372.

[6] Hautanena A，Lanlinen L，Kupari M，et al. Associations between aldosterone synthase gene polymorphism and the adrenocortical function in males[J]. J Intern Med，1998，244（1）：11-18.

[7] Tsujita Y，Iwai N，Katsuya T，et al. Lack of association between genetic polymorphism of CYP11B2 and hypertension in Japanese： the suita study[J]. Hypertens Res，2001，24（2）：105-109.

（收稿日期：2013-11-18）