湛 江，張書(shū)萍，譚彩霞，伍輝軍，高學(xué)文*

(1.金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部，江蘇 南京 211169； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

Harpin是一類(lèi)由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的富含甘氨酸、對(duì)熱穩(wěn)定、對(duì)蛋白酶K敏感，能在非寄主植物上引起過(guò)敏反應(yīng)的蛋白，同時(shí)能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生許多有益性狀，包括病蟲(chóng)抗性、增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)等[1-5]。HarpinXooc是由水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)hrf2基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，親水，對(duì)熱穩(wěn)定，等電點(diǎn)約為4.5，含138個(gè)氨基酸，分子量約為15.3×103Da[6-7]。

HarpinXooc蛋白的純化對(duì)于其結(jié)構(gòu)和生物活性的研究至關(guān)重要。目前，融合標(biāo)簽技術(shù)已大量用于重組蛋白質(zhì)純化，常用的蛋白純化標(biāo)簽是GST、His和表位標(biāo)簽。其中，His標(biāo)簽具有對(duì)金屬離子有高度的選擇性和親和力、與金屬離子的結(jié)合不受變性劑(尿素、肌)的影響、溫和多樣的洗脫條件等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也受到很多因素制約，如融合標(biāo)簽系統(tǒng)的純化條件、融合蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)、緩沖液及融合標(biāo)簽的可去除性等[8]。據(jù)此，本研究對(duì)His-HarpinXooc的純化條件和標(biāo)簽去除等進(jìn)行了優(yōu)化和摸索。同時(shí)，為了更加深入地了解和運(yùn)用His-HarpinXooc蛋白，本研究分析了該融合蛋白的產(chǎn)量、等電點(diǎn)和生物活性等。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

載體pET30a(+)-hrf2：攜帶水稻白葉枯菌編碼Harpin的hrf2基因，具卡那霉素(Km)抗性(50 μg/mL)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理實(shí)驗(yàn)室(下簡(jiǎn)稱(chēng)“實(shí)驗(yàn)室”)構(gòu)建；工程菌BL21/pET30a(+)-hrf2：用作表達(dá)HarpinXooc蛋白，具卡那霉素抗性(50 μg/mL)，實(shí)驗(yàn)室保存；工程菌BL21/pET30a(+)：用作空白對(duì)照，具卡那霉素抗性(50 μg/mL)，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥品和試劑

1) Enterokinase(EK)蛋白酶：購(gòu)自南京金斯瑞科技有限公司，2 U/μL；

2) 蛋白純化所用的試劑盒(HisTrap HP Kit)：購(gòu)自Amersham Biosciences (USA)公司；

3) 2 M 咪唑：取咪唑13.62 g，加純水90 mL完全溶解，濃HCl調(diào)pH=7.4，加純水定容到100 mL。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定與方法

1.3.1 His-HarpinXooc蛋白的表達(dá)和SDS-PAGE分析 將BL21/pET30a(+)-hrf2在含有Km(50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基平板上活化，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5左右，加入終濃度為1 mM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，收集菌體，滅菌水漂洗1次，使用20 mM或80 mM的咪唑懸浮菌體，加入終濃度為0.1 mM的蛋白酶抑制劑PMSF。超聲波破碎后收集上清，作為蛋白粗提液。取樣品液20 μL，與1/4體積的5×SDS加樣緩沖液混合，100 ℃沸水浴7 min，冷卻后電泳。

1.3.2 HarpinXooc蛋白的純化 純化之前，按照HisTrap HP Kit說(shuō)明書(shū)制備蛋白樣品，然后用0.45 μm濾膜過(guò)濾，去除一些細(xì)胞碎片或其它雜質(zhì)，以免阻塞鎳柱，純化時(shí)使用注射器上樣。

1.3.3 BSA內(nèi)標(biāo)法測(cè)定蛋白濃度 將BSA分別稀釋成100、250和500 μg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，與蛋白樣本同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)BioImage軟件分析His-HarpinXooc蛋白的濃度。

1.3.4 Bradford法測(cè)定蛋白濃度 將BSA分別稀釋成100、200、400、600、800 μg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，在595 nm 下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，數(shù)值與蛋白質(zhì)濃度成正比。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定蛋白濃度。

1.3.5 蛋白的透析 將His-HarpinXooc蛋白注入處理過(guò)的透析袋后，將透析袋置于裝有透析緩沖液的燒杯中，置于4 ℃透析24 h，每隔4～6 h更換一次透析液。

1.3.6 蛋白的酶切和濃縮 純His-HarpinXooc蛋白溶于酶切緩沖液中，約按照50 μg蛋白/U的比例加入Enterokinase，酶切條件為22 ℃ 16 h。將蛋白溶液置于MILLIPORE濃縮柱內(nèi)，5 000 rpm離心15 min，最終將蛋白溶液濃縮約10倍。

1.3.7 蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 在試管中配制不同pH的乙酸-乙酸鈉或磷酸緩沖液，加入經(jīng)透析脫鹽的His-HarpinXooc蛋白溶液(終濃度約為100 μg/mL)，輕微振蕩，測(cè)量pH值后靜置10 min，觀(guān)察現(xiàn)象。

圖1 濃度遞增的咪唑溶液洗脫His-HarpinXoocFig.1 Purification of His-HarpinXooc using imidazole of different concentration注：M代表蛋白marker；1代表第1～5 mL流出液 (150 mM 咪唑)；2代表第6～10 mL 流出液(200 mM咪唑)；3代表第11～15 mL流出液(250 mM咪唑)；4代表第16～20 mL流出液 (300 mM咪唑)；5代表第21～25 mL 流出液(500 mM咪唑)

1.3.8 煙草過(guò)敏反應(yīng) 分別用滅菌水和空白對(duì)照、蛋白溶液注射煙草Xanthi葉片，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后(16 h光照，8 h黑暗，25 ℃)，觀(guān)察葉片是否出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 使用HisTrap純化HarpinXooc蛋白的條件優(yōu)化

在已結(jié)合His-HarpinXooc粗提液的鎳柱中依次注入20、40、60、80和100 mM咪唑各5 mL洗脫非特異性蛋白，按照以下不同的洗脫方案對(duì)His-HarpinXooc蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)SDS-PAGE電泳圖觀(guān)測(cè)蛋白純度，優(yōu)化純化條件。

2.1.1 洗脫液中咪唑濃度對(duì)蛋白純化的影響 如圖1所示，采用150 mM咪唑洗脫后得到的HarpinXooc融合蛋白純度高，電泳條帶無(wú)雜帶，而當(dāng)咪唑濃度逐漸升高至250 mM時(shí)，會(huì)將一些結(jié)合力較強(qiáng)的雜蛋白洗脫出來(lái)，繼續(xù)使用更高濃度咪唑(300～500 mM)進(jìn)行洗脫時(shí)，雜帶逐漸被去盡，流出液又恢復(fù)為高純度的His-HarpinXooc蛋白。因而，針對(duì)與鎳柱結(jié)合的蛋白粗提液，在20～100 mM咪唑洗脫之后，采用150 mM咪唑溶液多次洗脫，更能獲得高純度的His-HarpinXooc蛋白(圖2)。

圖2 150 mM咪唑溶液洗脫His-HarpinXoocFig.2 Purification of His-HarpinXooc using 150 mM imidazole注：A代表使用20 mM咪唑溶液懸浮菌體；B代表使用80 mM咪唑溶液懸浮菌體；M代表蛋白marker；1代表第1～5 mL 流出液；2代表第6～10 mL流出液；3代表第11～15 mL流出液；4代表第16～20 mL流出液；5代表第21～25 mL流出液。

2.1.2 蛋白粗提液中咪唑濃度對(duì)蛋白純化的影響 較低濃度的咪唑可置換非特異性結(jié)合的蛋白，因而，在蛋白粗提液中含有一定濃度的咪唑時(shí)，有利于粗提液在過(guò)鎳柱時(shí)，阻止非特異性蛋白與鎳柱結(jié)合。本試驗(yàn)分別采用20 mM和80 mM的咪唑作為細(xì)胞破碎懸浮液，即在蛋白粗提液中咪唑的濃度分別為20 mM和80 mM。結(jié)果顯示，在采用同樣的洗脫溶液的情況下，采用20 mM咪唑作為細(xì)胞破碎懸浮液(圖2A)與采用80 mM咪唑(圖2B)時(shí)純化的結(jié)果大致相同，純化所得條帶都無(wú)雜帶。

2.1.3 洗脫緩沖液對(duì)蛋白純化的影響 為了弄清溶解咪唑的緩沖液對(duì)蛋白結(jié)合作用力的影響，我們分別觀(guān)測(cè)PBS-咪唑緩沖液和Tris-咪唑緩沖液對(duì)蛋白純化的影響。結(jié)果顯示，PBS-咪唑緩沖液(圖3A)和Tris-咪唑緩沖液(圖3B)對(duì)蛋白純化影響的區(qū)別不大。同時(shí)，在咪唑濃度為150 mM時(shí)洗脫得到的HarpinXooc融合蛋白純度高，當(dāng)咪唑濃度逐漸升高至500 mM時(shí)，也會(huì)將一些結(jié)合力較強(qiáng)的雜蛋白洗脫出來(lái)，與2.1.1結(jié)果一致。

圖3 不同的緩沖液洗脫His-HarpinXoocFig.3 Purification of His-HarpinXooc using different elution buffer注：A代表PBS-咪唑；B代表Tris-咪唑第一次；C代表Tris-咪唑第二次；M代表蛋白marker；1代表第1～5 mL流出液(150 mM)；2代表第6 mL 流出液(500 mM)；3代表第7 mL流出液(500 mM)；4代表第8 mL流出液(500 mM)；5代表第9 mL流出液(500 mM)

2.1.4 純化次數(shù)對(duì)蛋白純化的影響 為了獲得純度更高的蛋白，我們將第一次純化所得的His-HarpinXooc蛋白溶液按一定比例稀釋后再次注入到鎳柱中，然后使用同樣濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，觀(guān)察經(jīng)兩次純化后的蛋白純度。圖3B是HarpinXooc融合蛋白經(jīng)過(guò)一次純化后的電泳圖，圖3C是蛋白在經(jīng)過(guò)兩次純化后的電泳圖。結(jié)果顯示，HarpinXooc融合蛋白經(jīng)過(guò)兩次純化后雜帶略微變少，但變化不明顯。

圖4 利用BSA內(nèi)標(biāo)法測(cè)定His-HarpinXooc蛋白濃度Fig.4 Analyzing the concentration of His-HarpinXooc with BSA internal standard method注：M代表蛋白marker；1代表His-HarpinXooc蛋白粗提液；2代表BSA(500 μg/mL)；3代表BSA(250 μg/mL)；4代表BSA(100 μg/mL)；5表示純His-HarpinXooc蛋白

2.2 His-HarpinXooc融合蛋白的產(chǎn)量、等電點(diǎn)及生物活性分析

2.2.1 His-HarpinXooc融合蛋白的產(chǎn)量 我們按照最佳純化方案進(jìn)行純化，并將所得純蛋白和蛋白粗提液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)，蛋白粗提液中His-HarpinXooc蛋白的量與純化后His-HarpinXooc蛋白的量差別不是很大，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)BioImage軟件測(cè)定，蛋白樣品中His-HarpinXooc蛋白的濃度約為1.0 mg/mL (圖4)。經(jīng)過(guò)換算，每升BL21/pET30a(+)-hrf2發(fā)酵液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和鎳柱純化，可提純His-HarpinXooc蛋白約20 mg。同時(shí)，我們用Bradford法對(duì)純化的His-HarpinXooc蛋白的濃度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果與BioImage軟件測(cè)定的結(jié)果一致。

表1His-HarpinXooc蛋白的等電點(diǎn)測(cè)定

Table1ThepIdeterminingofHis-HarpinXooc

pH值His-HarpinXooc溶液的現(xiàn)象 3.7- 3.9+4.1++4.3+++4.5+++4.7++++4.9++5.2++5.4+5.6+5.9+6.1+6.3-

注:“++++、+++、++、+”分別表示渾濁程度,

“-”表示澄清。

2.2.2 His-HarpinXooc蛋白等電點(diǎn)測(cè)定 本試驗(yàn)通過(guò)聚沉法測(cè)定His-HarpinXooc蛋白的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小，溶液的混濁度最大，通過(guò)配制不同pH的緩沖液，觀(guān)察蛋白質(zhì)在這些緩沖液中的溶解情況可判斷蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，最混濁的一管溶液的pH值即可推測(cè)為該蛋白的等電點(diǎn)。表1顯示，通過(guò)測(cè)定，當(dāng)pH<3.7或>6.3時(shí)，His-HarpinXooc蛋白溶液澄清，表示His-HarpinXooc蛋白完全可溶。在pH為4.7時(shí)His-HarpinXooc蛋白的溶液最渾濁，溶解度最小，據(jù)此可判斷，His-HarpinXooc蛋白的等電點(diǎn)約為4.7，且His-HarpinXooc蛋白在pH大于4.7時(shí)帶負(fù)電。

2.2.3 His-HarpinXooc蛋白的生物活性 為了檢測(cè)His-HarpinXooc蛋白的生物活性，本試驗(yàn)使用不同溶液注射煙草 (N.tabacum, Xanthi) 葉片后，產(chǎn)生反應(yīng)不同 (圖5)。水、BL21細(xì)胞超聲破碎上清液及BL21/pET30細(xì)胞超聲破碎上清液均不能引起過(guò)敏反應(yīng)，而熱處理(100 ℃水浴10 min)前、后的BL21/pET30-hrf2細(xì)胞破碎上清液均能夠在煙草葉片上引起典型的過(guò)敏反應(yīng)，即熱處理前、后的His-HarpinXooc均能引起過(guò)敏反應(yīng)。考慮到Harpin蛋白的兩大基本特性，熱穩(wěn)定性和在非寄主植物上誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，我們認(rèn)為，HarpinXooc蛋白與His標(biāo)簽融合并不影響其熱穩(wěn)定性和在非寄主植物上誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的能力。

2.2.4 His-HarpinXooc蛋白的酶切分析 BL21/pET30-hrf2誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞破碎上清液，經(jīng)過(guò)HisTrap HP Kit層析柱并用咪唑洗脫，純化得到約25 kD大小的His-HarpinXooc蛋白。經(jīng)過(guò)Enterokinase (EK) 酶的酶切，切下His標(biāo)簽，這樣就分別得到了His和HarpinXooc蛋白，再經(jīng)過(guò)鎳柱，得到去除標(biāo)簽的純HarpinXooc蛋白。如圖6所示，酶切后的HarpinXooc蛋白的大小近17 kD，符合HarpinXooc蛋白的理論大小。純HarpinXooc蛋白可用于研究蛋白結(jié)構(gòu)等。為了更好地保持蛋白的活性，我們通過(guò)MILLIPORE濃縮柱將純HarpinXooc蛋白濃縮約10倍，使蛋白濃度升高，有利于蛋白的保存。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)使用構(gòu)建的BL21/pET30a(+)-hrf2菌株，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)HarpinXooc，經(jīng)過(guò)HisTrap HP Kit層析柱并用咪唑洗脫，純化得到His-HarpinXooc蛋白，并分析所得蛋白的產(chǎn)量、等電點(diǎn)和生物活性。結(jié)果表明，His-HarpinXooc蛋白的熱穩(wěn)定性高，能夠誘導(dǎo)煙草的過(guò)敏反應(yīng)，與純HarpinXooc和帶GST標(biāo)簽的HarpinXooc融合蛋白類(lèi)似。在用最佳純化方案進(jìn)行純化時(shí)，每升發(fā)酵液收獲純His-HarpinXooc蛋白20 mg，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示無(wú)雜帶。李明等曾用GST基因融合表達(dá)系統(tǒng)對(duì)HarpinXooc進(jìn)行純化，產(chǎn)量約為6 mg/L[9]，本試驗(yàn)表達(dá)純化所得的HarpinXooc產(chǎn)量較高，為20 mg/L。His-HarpinXooc蛋白的等電點(diǎn)為4.7，與不帶有His標(biāo)簽的HarpinXooc蛋白的等電點(diǎn)4.5[6]接近。

圖5 His-HarpinXooc誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的能力Fig.5 Hypersensitive response induced with His-HarpinXooc 注：1代表水；2代表BL21細(xì)胞破碎上清液；3代表BL21/pET30細(xì)胞破碎上清液；4代表BL21/pET30-hrf2細(xì)胞破碎上清液(熱處理前)；5代表BL21/pET30-hrf2細(xì)胞破碎上清液(熱處理后)

圖6 Enterokinase酶切His-HarpinXooc的分析Fig.6 The analysis of His-HarpinXooc digested with Enterokinase注：M代表蛋白marker；1代表酶切前的His-HarpinXooc蛋白；2代表酶切后的His-HarpinXooc蛋白；3代表經(jīng)酶切后過(guò)鎳柱所得的純HarpinXooc蛋白；4代表將純HarpinXooc蛋白濃縮10倍

對(duì)His標(biāo)簽的HarpinXooc融合蛋白的純化條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在使用咪唑洗脫的過(guò)程中，咪唑濃度對(duì)蛋白純化影響較大，而懸浮液中咪唑濃度、緩沖液類(lèi)型和純化次數(shù)對(duì)蛋白純化影響較小。研究認(rèn)為，綜合考慮HarpinXooc蛋白的純度、產(chǎn)量以及純化時(shí)節(jié)約成本、簡(jiǎn)化步驟，His-HarpinXooc蛋白的最佳純化方案為：使用20 mM咪唑懸浮菌體，依次使用5 mL的20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mMPBS-咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫(主要目的是洗脫掉雜蛋白)，然后用150 mM咪唑進(jìn)行洗脫(主要目的是洗脫出His-HarpinXooc蛋白)并收集洗脫液，至洗脫液中蛋白含量明顯減少。研究表明，利用HisTrap HP Kit對(duì)His-HarpinXooc進(jìn)行純化，方法簡(jiǎn)便，純度高，產(chǎn)量和生物活性均不受影響，等電點(diǎn)與不帶His標(biāo)簽的HarpinXooc接近。

本試驗(yàn)旨在對(duì)His-HarpinXooc融合蛋白的產(chǎn)量、等電點(diǎn)和生物活性進(jìn)行一些初步的研究，以在后續(xù)的試驗(yàn)中，為制備載HarpinXooc蛋白的納米粒提供基礎(chǔ)[10-11]，有利于更好地研究HarpinXooc蛋白的結(jié)構(gòu)以及提供較好的材料。對(duì)于His-HarpinXooc蛋白結(jié)構(gòu)上的一些具體性質(zhì)，本試驗(yàn)未作探討，有待進(jìn)一步研究。

[1] Wei Z M, Laby R J, Zumoff C H, et al. Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant PathogenErwiniaamylovora[J].Science,1992,257:85-88

[2] Dong H, Delaney T P, Beer S V. Harpin Induces Disease Resistance in Arabidopsis through the Systemic Acquired Resistance Pathway Mediated by Salicylic Acid and the NIM1Gene[J]. Plant J.,1999,20:207-215

[3] Bauer D W, Wei Z M, Beer S V, et al.ErwiniachrysanthemiHarpinEch:an Elicitor of the Hypersensitive Response that Contributes to Soft-rot Pathogenesis[J].Mol. Plant Microbe Interact,1995,8(4):484-491

[4] Qiu D, Wei Z M, Bauer D W, et al. Treatment of Tomato Seed with Harpin Enhances Germination and Growth and Induces Resistance toRalstoniasolanacearum[J].Phytopatholgy,1997,87:1-10

[5] Zitter T A, Beer S V. Harpin for Insect Control [J].Phytopathology,1998,88:104-105

[6] 陸徐忠, 王金生.新型水稻黃單胞菌Harpin蛋白的純化及其特性研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2006,27(5):875-879

[7] Li P, Lu X, Shao M, et al.Genetic Diversity of Harpins fromXanthomonasoryzaeand their Activity to Induce Hypersensitive Response and Disease Resistance in Tobacco[J].Science in China Ser. C Life Sciences,2004,47(5):461-469

[8] 李淑娟.六聚組氨酸融合蛋白純化方法研究[D].陜西：西北大學(xué),2007

[9] 李明.HarpinX蛋白的純化、抗體制備及轉(zhuǎn)hrfX基因棉花的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005

[10] 湛江，楊揚(yáng)，寧輝，等.載HarpinXooc蛋白納米粒的制備及生物學(xué)效應(yīng)測(cè)定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010(3):57-61

[11] Zhan J, Wu H J, Yang Y, et al.Preparation and Characterization of Chitosan-HarpinXoocNanoparticles[J].Asian Journal of Chemistry,2013(18):10368-10372