錢清華

（連云港職業(yè)技術學院，江蘇連云港222006）

超聲間歇輔助酶解對蝦下腳料蛋白的工藝優(yōu)化

錢清華

（連云港職業(yè)技術學院，江蘇連云港222006）

采用超聲波間歇協(xié)助胰蛋白酶水解對蝦下腳料蛋白制備低分子肽。以水解度為指標，利用Box-Behnken中心組合設計原理和響應面分析法，對酶解工藝條件進行了優(yōu)化，建立了加酶量、超聲波處理次數(shù)（時間）、酶解溫度與水解度之間的數(shù)學模型。結果表明，最佳工藝條件為：加酶量為46.42 kat/g，超聲處理次數(shù)為3次，每次5min，間歇10min，酶解溫度為44.3℃，在此條件下水解度為62.21%，與理論計算值60.65%基本一致。水解產(chǎn)物中必需氨基酸含量占氨基酸總量的44.5%；構成肽的氨基酸占總氨基酸的比例為85.6%，低分子肽是蛋白水解液的主要成分。

對蝦下腳料蛋白；酶解；超聲波；水解度

對蝦營養(yǎng)豐富，富含糖元、蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素等成分，脂肪含量低，且多為不飽和脂肪酸，蛋白質容易消化吸收。隨著我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，蝦產(chǎn)量不斷增加，生產(chǎn)的蝦多數(shù)用于加工成無頭蝦仁，而占蝦體重量30%～40%的蝦頭被剔除，其中大部分被用于生產(chǎn)飼料，大大降低了蝦的利用價值。蝦頭含有腦磷脂、卵磷脂、維生素、Ca、P、Fe、Zn以及類胡蘿卜素、蛋白質和脂肪等營養(yǎng)成分。因此，蝦頭綜合利用是提高蝦利用價值的重要途徑[1-4]。有關蝦粉[5]、蝦殼[6]、蝦下腳料[7]等的研究受到廣泛關注。將水產(chǎn)動物蛋白尤其是海產(chǎn)品蛋白酶解后，其中不再含易致過敏的蛋白和嘌呤，解決了部分人群不適用的問題，可以應用于方便食品、休閑食品、高檔調(diào)味料和營養(yǎng)強化食品。

在前期工作的基礎上，把超聲波技術應用到對蝦下腳料蛋白酶解過程中，采用間歇超聲處理，以水解度為指標，在單因素試驗的基礎上用響應面分析法對酶解工藝條件進行優(yōu)化，制備營養(yǎng)豐富的蛋白酶解液，經(jīng)過濃縮后得到多肽和氨基酸粉末。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白酶：國藥集團化學試劑有限公司，酶活力為833.33 kat/g；對蝦下腳料蛋白：自制；氫氧化鈉、鹽酸均為分析純。

1.2 主要儀器

JJ-2型組織搗碎勻漿機：江蘇省金壇市江南儀器廠；TD4型電動離心機：湖南儀器儀表總廠離心機廠；PHS-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：江蘇金壇大地自動化儀器廠；OYA-A120超聲器（150W，28 KHz）：蘇州歐亞超聲波設備有限公司；Agilent1100高效液相色譜儀：安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波輔助酶解

將蝦下腳料提取?；撬岷蜕镤\[8]后，在剩余的蝦蛋白質濕料中，加入3倍體積的純水，調(diào)節(jié)pH至7.0，加熱至一定溫度后，加一定量的胰蛋白酶，并超聲波處理5min，超聲波功率為80W，間隔10min后，再用超聲處理5min，如此操作，保持該溫度酶解一定時間，通過加入1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使pH穩(wěn)定在7.0，酶解完成后將酶解液加熱至95℃，并保持10min，滅酶。

1.3.2 分析方法

總氮測定：采用GB 5009.5—2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定。

式中：V1為樣品滴定消耗鹽酸標準溶液的體積，mL；V0為空白滴定消耗鹽酸標準溶液的體積，mL；C為標準鹽酸溶液的濃度，（mol/L）；m為樣品質量，g；0.014為1mol/L鹽酸標準滴定溶液相當?shù)馁|量，g。

游離氨基酸含量測定：采用高效液相色譜分析，按JY/T019-1996《氨基酸分析方法通則》、GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定方法》。

氨基氮測定：采用中性甲醛電位滴定法[9]。

式中：V1′為樣品消耗的NaOH標準溶液的體積，mL；V0′為空白消耗NaOH標準溶液的體積，mL；c為NaOH標準溶液的濃度，（mol/L）；m為樣品的質量，g。

水解度計算：

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

選取對酶解工藝有顯著影響的酶用量、超聲處理次數(shù)和酶解溫度3個主要因素進行單因素試驗，結果說明水解度最大的條件分別是：酶用量為41.67 kat/g，超聲處理次數(shù)3次，酶解溫度45℃。在單因素試驗結果的基礎上，進行正交回歸試驗，利用Box-Behnken的中心組合設計原理，進行響應面法中的Box-Behnken實驗，以酶用量（U/g蛋白質）、超聲處理次數(shù)、酶解溫度（℃）3個因素為自變量，分別用X1，X2，X3表示，以水解度為響應值，每一個自變量的低、中、高試驗水平分別以-1，0，1編碼，考察各因素對提取工藝的影響和因素間的交互作用，確定最佳的酶解條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 因素水平編碼表Table1 Test codeand correspondingly origin level

2結果與分析

2.1 試驗結果

按照表1方案進行試驗，所得水解度結果見表2。

表2 試驗設計及結果Table2 Box-Behnken design and corresponding experimental results

模型共設17個試驗，其中有12個析因試驗，5個中心試驗。析因試驗構成三維定點，中心試驗為區(qū)域的中心。從表中可以看出，水解度最高值為61.3%。比文獻報道的單酶水解蛋白的水解度高，這是因為超聲輔助的作用，超聲產(chǎn)生的瞬間內(nèi)爆的強烈振動波，能形成短暫的高能環(huán)境，這些能量可以打開化學鍵，利于蛋白分子的分解。

2.2 模型建立

運用Design-Expert軟件對上述結果進行多元擬合，得到加酶量（X1）、超聲處理次數(shù)（X2）、酶解溫度（X3）與水解度（DH）關系的回歸方程預測模型為：

對擬合的二次回歸模型方程求一階偏導，令導數(shù)等于0，得X1=0.57，X2=0.61，X3=-0.07。即加酶量為46.42kat/g，超聲處理次數(shù)為2.61次，酶解溫度為44.3℃，水解度計算值為60.65%。該模型的R2=0.9101，RAdj2= 0.794 4，表明該模型與實際擬合較好。信噪比8.142高于臨界值4，表明二次多元回歸模型極其顯著。

2.1.3 方差分析

對試驗結果進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance of the regression model

從表3中可見，自變量（加酶量、超聲處理次數(shù)、溫度）與響應值（蛋白水解度）之間線性關系顯著?；貧w方程各項的方差分析結果還表明，加酶量、超聲處理次數(shù)的一次項均達到極顯著水平（P＜0.01），加酶量的二次項、超聲處理次數(shù)的二次項、溫度的二次項均達到高度顯著水平（P＜0.05）；模型的失擬P值為0.229 2，大于0.05，不顯著，說明該模型的失擬結果較好。誤差項不顯著，說明回歸方程與實際情況吻合度較好。根據(jù)F值的大小，可以判定各試驗因素對響應值的影響依次是：X1〉X2〉X3。即酶用量影響最大，超聲處理次數(shù)影響次之，酶解溫度影響相對較小。因此，可以用該模型回歸方程代替真實試驗點對試驗結果進行分析。

2.1.4 響應面分析

通過響應面圖形可以看出各試驗因素對響應值的影響，進一步研究變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點。圖1是加酶量與超聲次數(shù)（時間）對水解度的影響，圖2是加酶量與酶解溫度對水解度的影響，圖3是溫度與超聲次數(shù)（時間）對水解度的影響。從響應面三維圖可知，在所選范圍內(nèi)存在極值，即響應面最高點。

圖1 加酶量與超聲處理次數(shù)對水解度影響的響應曲面和等高線圖Fig.1 Response surface chart and contour showing the effects of enzyme dosage and ultrasonic treatment on degree of hydrolysis

由圖1可見，響應曲面的坡度相對較為陡峭，表明響應值（蛋白水解度）受溫度和超聲次數(shù)（時間）的影響比較大。當加酶量在43.75 kat/g～56.67 kat/g之間，超聲次數(shù)在2.2～3.8次范圍內(nèi)對蛋白水解度最有利，從等高線可直觀看出兩因素間有交互作用，但影響不顯著。

圖2 加酶量與溫度對水解度影響的響應曲面和等高線圖Fig.2 Response surface chart and contour showing the effects of enzyme dosage and hydrolysis temperature on degree of hydrolysis

圖3 酶解溫度與超聲處理次數(shù)對水解度影響的響應曲面和等高線圖Fig.3 Response surface chart and contour showing the effects of hydrolysis temperature and ultrasonic treatment on degree of hydrolysis

由圖2可以看出：隨著溫度的升高，蛋白水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；隨著酶用量的增加，蛋白水解度也呈先上升后緩慢下降的趨勢。在溫度的變化范圍處于38℃～48℃、加酶量45.83 kat/g～56.67 kat/g范圍內(nèi)，蛋白水解度較高，從等高線可直觀看出兩因素的交互作用比超聲處理次數(shù)和加酶量的交互作用稍弱。

由圖3可以看出，響應曲面的坡度在超聲處理坐標顯示相對較為陡峭，表明響應值（蛋白水解度）對超聲處理次數(shù)的改變較為敏感，而對溫度的敏感度較小，在溫度的變化范圍處于37℃～47℃、超聲處理2.8～3.8時，蛋白水解度有較大值，從等高線可看出兩因素的有交互作用。

2.1.5 回歸模型的驗證試驗

采用上述優(yōu)化條件進行水解度試驗，以檢驗響應面分析所得結果的可靠性，水解條件為加酶量46.42kat/g，超聲處理次數(shù)3次，每次5min，間歇10min，酶解溫度44.3℃，在此條件下試驗3次，水解度平均為62.21%，與理論水解度60.65%基本一致，表明該模型很好的反映了胰蛋白酶水解工藝參數(shù)的可行性。

2.3 水解產(chǎn)物的氨基酸組成分析

將水解產(chǎn)物進行氨基酸組成分析，結果如表4所示。

表4 酶水解產(chǎn)物的氨基酸分析Table4 Analysisamino acid of hydrolysate g/100 g

從表4可以看出，水解產(chǎn)物中含17種游離氨基酸，色氨酸未檢測，其中，必需氨基酸含量占氨基酸總量的44.5%；在必需氨基酸中，亮氨酸的含量最高，為1.085mg/g。天冬氨酸、谷氨酸等鮮味氨基酸含量豐富。構成肽的氨基酸占總氨基酸的比例為85.6%，游離氨基酸占總氨基酸的比例為13.4%。因此，水溶性低分子肽是蛋白水解的主要成分。

3結論

利用間歇超聲作用方法輔助酶水解對蝦下腳料蛋白，經(jīng)過響應面分析，得到最佳水解工藝條件為：胰蛋白酶用量為46.42 kat/g，超聲處理次數(shù)為3次，每次5min，每次間歇10min，酶解時間共為45min，酶解溫度44.3℃，水解度為60.65%；在此工藝條件下驗證實驗，試驗3次的水解度平均值為62.21%。水解產(chǎn)物中，水溶性低分子肽是帶魚水解蛋白的主要成分，必需氨基酸含量占氨基酸總量的44.5%；構成肽的氨基酸占總氨基酸的比例為85.6%，游離氨基酸占總氨基酸的比例為13.4%。本方法能縮短酶解時間，降低能耗，降低成本，在用于生產(chǎn)功能食品的原料方面具有實用價值。

[1]Kim S-K,Mendis E.Bioactive compounds from marine processing byproducts-A review[J].Food Research International,2006,39：383-393

[2]Kim,SK,Wijesekara I.Development and biological activities of marine-derived bioactive peptides：A review[J].Journal of functional foods,2010(2)：1-9

[3]崔秀明,汪之和,施文正.南極磷蝦粗蝦油提取工藝優(yōu)化[J].食品科學,2011,32(24)：126-129

[4]Valdez-Pe?a AU,Espinoza-Perez JD,Sandoval-Fabian GC,etal. Screening of industrial enzymes for deproteinization of shrimp head for chitin recovery[J].Food Science and Biotechnology,2010,19(2)：553-557

[5]韓曉祥,郭小旬,勵建榮.中國對蝦調(diào)味料風味前體物質酶解制備工藝研究[J].中國食品學報,2012,12(4)：100-106

[6]吳求林,鄭寶東.響應面法優(yōu)化蝦殼酶解的工藝[J].福建農(nóng)林大學學報：自然科學版,2011,40(1)：80-84

[7]錢清華.一種從蝦頭及蝦下腳料中同步提取?；撬岷图讱に丶岸嚯牡姆椒?中國,201210137815.5[P].2012-05-07

[8]錢清華.從對蝦頭及蝦下腳料中提取生物鋅和?；撬岬墓に噧?yōu)化[J].食品科技,2013(1)：308-312

[9]黃偉坤.食品分析與檢驗[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1995：56-63

Optimization of Hydrolysis of Prawn Leftover Protein Using Trypsin Assisted by In term it tent Ultrasonic Method

QIANQing-hua
（Lianyungang Technological College，Lianyungang222006，Jiangsu，China）

The protein of prawn leftover was hydrolyzed with trypsin assisted by intermittent ultrasonic method for preparing low molecular weight peptides.Taking hydrolysis degree as response values，the mathematical regression model of the relationships between the studied factors and the degree of hydrolysis of protein was constructed by means of the principles of Box-Benheken central composite experimental design and response surface analysis.Results showed that the optimum hydrolysis conditions was based on trypsin-catalyzed reaction by intermittent treatment with ultrasonic for3 times at44.3℃and 46.42 kat/g protein enzyme dose，5min every time and 10min intermittent.Under these conditions，the degree of hydrolysis was62.21%，which was close to the estimated value60.65%obtained by using regression model.The hydrolysate contains essential amino acids，whose content was44.5%of the totalamino acids.The amino acids constituted peptides were 85.6%of the total amino acids.The low molecular weight peptides were the main components of hydrolysate.

prawn leftover protein；enzymatic hydrolysis；ultrasonic；degree of hydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.15.019

2013-11-12

江蘇省高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進工程項目（JH10-66）

錢清華（1965—），女（漢），教授，博士，主要從事海洋生物資源的開發(fā)利用技術研究。